一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，包括如下步骤，1)制备携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞；2)将步骤1)制备的携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞注射到去除了乳腺芽的乳腺脂肪垫，注射细胞量为5×10

【技术实现步骤摘要】
一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法
本专利技术属于生物反应器
，尤其是涉及一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法。
技术介绍
动物生物反应器是利用转基因活体动物,在其器官或组织中高效表达某种外源蛋白,并进行工业化生产功能蛋白质的技术。根据目的蛋白表达部位的不同,可分为乳腺、血液、蛋清、尿液、精囊腺、唾液腺等生物反应器。由于乳腺有高表达重组蛋白以及翻译后修饰的能力，乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商业化的生物反应器。自1987年首次构建转基因小鼠乳腺生物反应器，并成功提取出组织型纤溶酶原激活剂以来，利用生物体生产重组蛋白质药物的新时代正式开启，以转基因动物为核心技术的生物制药公司相继建立。用于生产外源蛋白的系统有很多种，比如多细胞生物，植物和动物，而目前转基因家畜的乳腺生产外源蛋白是比较常用的系统。这种制备乳腺生物反应器的技术方法都是将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，从而获得转基因动物，利用雌性动物产仔后乳腺分泌乳汁的特点，在乳汁中源源不断地获得外源性蛋白。然而这一技术方法的缺点非常明显，主要包括技术操作要求高，周期较长以及费用较高，转基因动物出生效率低，外源基因在动物体内存在非定点整合的风险，外源基因在动物乳腺中特异性表达效率低，动物伦理以及生物安全性风险等问题。且转基因动物的生产周期较长，因此，需要一个新的方法去弥补相应不足。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，本专利技术利用体细胞转分化获得的功能性乳腺上皮细胞建立一种制备新型转基因乳腺生物反应器的简单且高效的方法。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，包括如下步骤，1)制备携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞；2)将步骤1)制备的携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞注射到去除了乳腺芽的乳腺脂肪垫，注射细胞量为5×104-1×106个细胞。优选的，步骤1)的外源基因为绿色荧光蛋白GFP。优选的，携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞的制备包括如下步骤，采取奶山羊耳尖组织进行分离培养获得成纤维细胞GEFs；然后将慢病毒重组质粒psin-Ef1a-GFP-puro与慢病毒包装载体VSVG和NRF共转染293T细胞，转染48-72h后收集病毒悬液，用于感染山羊成纤维细胞；后续用嘌呤霉素进行筛选，获得稳定表达GFP的山羊成纤维细胞GFP-GEFs；再使用小分子化合物对GFP-GEFs进行诱导获得携带绿色荧光蛋白GFP的小分子化合物诱导转分化山羊乳腺上皮细胞GFP-CiMECs；优选的，嘌呤霉素的浓度为1-6μg/ml。优选的，所述小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、RepSsox、SB431542、SB525334、SB505124、LDN-193189、LDN-214117、LDN-212854、K02288、A-83-01、SP600125、SB20358、LY2157299、LY2109761、BIBF-0775、TP0427736HCL、SD-208、Vactosertib中的一种或两种以上。优选的，步骤2)中，裸鼠乳腺芽部位脂肪垫MFP的清除包括如下步骤，1)取21-28d的受体裸鼠，腹腔注射质量分数2.5％的阿维菌素(生理盐水稀释)200-400μL麻醉；2)将裸鼠放在塑料板上，刮去腹部的毛，体积分数75％医用酒精消毒腹部后，用剪刀在腹部中线纵向切开1cm的切口；3)从中线切口底部到大腿上方的臀部区域做两个0.5cm切口；用镊子将皮肤从腹膜中拉开，露出乳腺并用镊子夹紧；4)手术去除乳头到淋巴结之间的MFP；5)最终含有乳腺芽的MFP被除去，剩下的乳腺MFP用于细胞注射。优选的，步骤2)中，CiMECs-GFP细胞在清除了乳腺芽的脂肪垫注射时，注射总体积为100μL-200μL/次，用1mL注射器将50μL-100μL细胞悬液和50μL-100μLMatrigel混合后注入切除乳腺芽后剩余的MFP中。本专利技术还提供一种如上所述的利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法在制备乳腺生物反应器中的应用。相对于现有技术，本专利技术所述的利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，具有以下优势：本专利技术是在体细胞中导入可以表达外源蛋白的基因获得转基因体细胞，然后再利用小分子化合物进行诱导，获得转基因的转分化乳腺上皮细胞，将该细胞注射到乳腺脂肪垫中就可以获得转基因乳腺生物反应器。这一技术方法有效的缩短了转基因乳腺生物反应器制备的周期，而且成本低，效率高，操作相对简单。本专利技术技术路线由转基因体细胞-转基因动物-转基因乳腺简化为转基因体细胞-转基因乳腺。另外本专利技术技术方法不需要通过胚胎技术来生产转基因动物从而获得转基因乳腺生物反应器，所以外源基因对动物本身的影响较小，而且外源基因也不会遗传到后代，生物安全性也相对较高。附图说明图1为转绿色荧光蛋白(GFP)的山羊成纤维细胞(GFP-GEFs)(a和b)以及转基因小分子化合物诱导转分化乳腺上皮细胞(GFP-CiMECs)(c和d)的常光及荧光形态图。标尺，100um；图2为GFP-CiMECs注射裸鼠切除乳腺芽的脂肪垫形成的转基因乳腺组织的切片图。荧光显微镜观察到GFP表达，说明该乳腺样组织是由山羊GFP-CiMECs形成。图中圈出部分表示的是表达GFP的乳腺腺泡结构。图3为GFP-CiMECs注射后形成的乳腺组织切片的H&E染色和抗体染色图。HE和IHC-P染色结果显示该乳腺组织以及腺泡结构正常，而且表达山羊乳腺上皮细胞的特异性蛋白CK14，CSN3和LTF。图中圈出部分表示的是乳腺腺泡结构。具体实施方式除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下面结合实施例来详细说明本专利技术。已成功在裸鼠去除了原乳腺芽的乳腺脂肪垫中获得表达绿色荧光蛋白(GFP)的乳腺生物反应器。一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因(绿色荧光蛋白GFP)乳腺生物反应器的方法，具体操作如下：(一)获得携带GFP的转分化乳腺上皮细胞(CiMECs-GFP)。1、从山羊耳尖组织分离获得山羊成纤维细胞(GEFs)(具体分离方法可参考专利申请号201911328267.2)。将慢病毒重组质粒psin-Ef1a-GFP-puro与慢病毒包装载体VSVG和NRF共转染293T细胞，转染60h后收集病毒悬液，用于感染山羊成纤维细胞。然后加3ug/ml嘌呤霉素进行筛选，连续筛选3天即可获得稳定表达GFP的山羊成纤维细胞(GFP-GEFs)。2、用小分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，其特征在于：包括如下步骤，/n1)制备携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞；/n2)将步骤1)制备的携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞注射到去除了乳腺芽的乳腺脂肪垫，注射细胞量为5×10

【技术特征摘要】
1.一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，其特征在于：包括如下步骤，
1)制备携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞；
2)将步骤1)制备的携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞注射到去除了乳腺芽的乳腺脂肪垫，注射细胞量为5×104-1×106个细胞。


2.根据权利要求1所述的利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，其特征在于：步骤1)的外源基因为绿色荧光蛋白GFP。


3.根据权利要求1所述的利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，其特征在于：携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞的制备包括如下步骤，采取奶山羊耳尖组织进行分离培养获得成纤维细胞GEFs；然后将慢病毒重组质粒psin-Ef1a-GFP-puro与慢病毒包装载体VSVG和NRF共转染293T细胞，转染48-72h后收集病毒悬液，用于感染山羊成纤维细胞；后续用嘌呤霉素进行筛选，获得稳定表达GFP的山羊成纤维细胞GFP-GEFs；再使用小分子化合物对GFP-GEFs进行诱导，获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的小分子化合物诱导转分化山羊乳腺上皮细胞GFP-CiMECs；优选的，嘌呤霉素的浓度为1-6μg/ml。


4.根据权利要求3所述的利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，其特征在于：所述小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、RepSox、SB431542、SB525334、SB505124、LDN-19318...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄奔，张丹丹，刘权辉，朱少倩，叶升，覃梁珊，李梦梅，胡吉刚，谢小莲，
申请(专利权)人：广西大学，广西犇彭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45