靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用。肿瘤乏氧区域常伴随着耐药性的发生，基于丙酮酸激酶M2型(PKM2)在顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中的表达高于敏感细胞，本发明专利技术通过在耐药细胞中干扰PKM2基因，增加顺铂耐药细胞内活性氧的水平并诱导细胞凋亡，实现对耐药细胞治疗的增敏作用，具有重要的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用。
技术介绍
肺癌是威胁人类健康和生命的恶性肿瘤之一，其中大约85％的患者是非小细胞肺癌(NSCLC)。化学疗法是肺癌的主要治疗方法，铂类化学药物疗法已成为晚期NSCLC患者的标准治疗方法。但是，临床耐药性仍然是一个挑战，极大地阻碍了治疗效果。因此，对耐药机制的更全面的了解对NSCLC患者的治疗具有重要意义。外泌体在肺癌的肿瘤发生中起重要作用。外泌体是晚期内体产生的膜结合囊泡，大小在40-160nm范围内，通过与质膜融合并从细胞释放到细胞外空间。外泌体包含不同的生物分子，包括各种类型的蛋白质、DNA和RNA，通过充当微环境中细胞通讯的信使而影响细胞功能。据报道，外泌体递送EphA2等蛋白能够增强胰腺癌的吉西他滨耐药性。因此，外泌体可能能够通过直接将生物分子转移到细胞或修饰微环境来影响细胞功能。缺氧是大多数恶性肿瘤中常见的现象，被认为是肿瘤微环境中与肿瘤耐药性和肿瘤发生有关的复杂因素。这种现象是由于肿瘤血管的不规则或肿瘤血管距离过长引起的肿瘤细胞供氧不足。肿瘤细胞可以通过多种细胞机制适应这种不利的缺氧环境，从而使肿瘤细胞更具抵抗力和生存能力，这也是其发生化疗耐药的原因之一。其中重要的变化之一是葡萄糖代谢的改变，肿瘤细胞从氧化磷酸化到糖酵解的转变，以满足肿瘤细胞的能量需求，这种被称为Warburg效应的肿瘤代谢重编程被认为是肿瘤的标志特征。丙酮酸激酶M2型(PKM2)是Warburg效应的重要调节蛋白，近年来由于其在促进代谢重编程中的作用而受到广泛关注。PKM2通过催化由磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合成丙酮酸以促进缺氧糖酵解而参与Warburg效应，缺氧糖酵解有助于肿瘤细胞生长，从而导致肺癌的恶性表征。缺氧肿瘤分泌的外泌体在肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用中起着重要的作用。据报道，缺氧肿瘤细胞的外泌体富含免疫抑制蛋白，可通过介导单核巨噬细胞的M2极化促进肿瘤进展。此外，缺氧可以增加外泌体的产生，从而促进肿瘤的细胞间通讯，这表明外泌体在缺氧肿瘤的恶性表型中发挥重要作用，包括化疗耐药性的发生。因此外泌体和PKM2对肿瘤耐药性的发生具有积极作用。
技术实现思路
鉴于外泌体和PKM2在缺氧条件下介导非小细胞肺癌化疗耐药性发生中的重要作用，本专利技术提供了干预PKM2或者外泌体中的PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的方法和应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术首先提供一种靶向外泌体PKM2的物质在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用，所述靶向外泌体PKM2的物质为PKM2抑制剂或含有靶向PKM2的shRNA序列的物质。进一步地，提供含有PKM2敲低的shRNA的表达载体在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用。含有靶向PKM2的shRNA序列的物质可以干预PKM2的表达。其中，含有靶向PKM2的shRNA序列的物质可以为含有靶向PKM2的shRNA序列的表达载体，或含有靶向PKM2的shRNA序列的慢病毒。进一步地，靶向PKM2的shRNA序列的第一条核苷酸序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，第二条核苷酸序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。进一步地，含有靶向PKM2的shRNA序列的表达载体为携带PKM2shRNA序列的穿梭质粒。进一步地，含有靶向PKM2的shRNA序列的慢病毒为：将穿梭质粒包装至慢病毒中获得的慢病毒，也称之为PKM2shRNA慢病毒。进一步地，提供PKM2的抑制剂在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用。PKM2的抑制剂可以干预PKM2的活性。本专利技术还提供靶向外泌体PKM2的物质和顺铂在制备非小细胞肺癌的药物上的应用，所述靶向外泌体PKM2的物质可以干预PKM2的表达或干预PKM2的活性，在同时使用顺铂的条件下能够增强细胞对顺铂的化疗敏感性。本专利技术还提供评价靶向外泌体PKM2对非小细胞肺癌顺铂耐药性的影响的方法，包括以下步骤：(1)构建PKM2过表达的真核表达载体；(2)用步骤(1)得到的PKM2过表达载体转染至对顺铂敏感的非小细胞肺癌细胞中并培养；(3)收集步骤(2)得到的PKM2过表达的细胞系培养后的培养液，通过超速离心法纯化外泌体，得到PKM2过表达的外泌体；(4)构建两条PKM2敲低的shRNA表达载体，并包装至慢病毒中；(5)用步骤(4)得到的PKM2shRNA慢病毒感染至顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中并培养；(6)收集步骤(5)得到的PKM2shRNA敲低的耐药细胞系培养后的培养液，通过超速离心法纯化外泌体，得到PKM2敲低的外泌体；(7)利用步骤(2)和步骤(5)得到的PKM2过表达和敲低的细胞系，同时施加顺铂处理，应用于评价PKM2对非小细胞肺癌顺铂耐药性的影响；(8)利用步骤(3)和步骤(6)得到的PKM2过表达和敲低的外泌体，与正常的敏感细胞共培养，并施加顺铂处理，应用于评价外泌体携带的PKM2对非小细胞肺癌顺铂耐药性的影响。进一步地，步骤(1)中所述的PKM2过表达的真核表达载体，所述的PKM2过表达的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。优选的，步骤(2)中所述的顺铂敏感的非小细胞肺癌细胞为A549细胞系。优选的，步骤(5)中所述的顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞为A549经长时间低浓度顺铂诱导而来的A549/CR细胞系。优选的，所述的A549细胞系，其培养液为90％DMEM基础培养基加10％的胎牛血清，培养条件为37℃、5％CO2、常氧(20％O2)。优选的，所述的A549/CR细胞系，其培养液为90％DMEM基础培养基加10％的胎牛血清，鉴于肿瘤缺氧与耐药间的相关性，A549/CR细胞系的培养条件设置为37℃、5％CO2、乏氧(1％O2)。本专利技术还提供靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的方法，包括以下步骤：将PKM2的shRNA或者PKM2抑制剂，与顺铂联合使用后，应用于抑制耐药细胞系的增殖，或者应用于抑制小鼠皮下肿瘤的生长。进一步地，PKM2的shRNA通过抑制糖代谢相关基因的mRNA的转录、促进耐药细胞凋亡、增加耐药细胞中的活性氧水平，实现对耐药细胞的抑制作用。优选地，糖代谢相关基因的mRNA的荧光定量PCR检测引物，其中：PDK1的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；MYC的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示；GLUT1的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:11所示；LDHA的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:12所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:13所示；C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向外泌体PKM2的物质在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用，其特征在于，所述靶向外泌体PKM2的物质为PKM2抑制剂或含有靶向PKM2的shRNA序列的物质。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向外泌体PKM2的物质在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用，其特征在于，所述靶向外泌体PKM2的物质为PKM2抑制剂或含有靶向PKM2的shRNA序列的物质。


2.根据权利要求1所述靶向外泌体PKM2的物质在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用，其特征在于，含有靶向PKM2的shRNA序列的物质可以为含有靶向PKM2的shRNA序列的表达载体，或含有靶向PKM2的shRNA序列的慢病毒。


3.根据权利要求1或2所述靶向外泌体PKM2的物质在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用，其特征在于，靶向PKM2的shRNA序列的第一条核苷酸序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，第二条核苷酸序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。


4.根据权利要求2所述靶向外泌体PKM2的物质在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用，其特征在于，含有靶向PKM2的shRNA序列的表达载体为携带PKM2shRNA序列的穿梭质粒。


5.根据权利要求2所述靶向外泌体PKM2的物质在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用，其特征在于，含有靶向PKM2的shRNA序列的慢病毒为：将携带PKM2shRNA序列的穿梭质粒包装至慢病毒中获得的慢病毒。


6.一种靶向外泌体PKM2的物质和顺铂在制备非小细胞肺癌的药物上的应用，其特征在于，所述靶向外泌体PKM2的物质可以干预PKM2的表达或干预PKM2的活性，在同时使用顺铂的条件下能够增强细胞对顺铂的化疗敏感性；所述靶向外泌体PKM2的物质为PKM2抑制剂或含有靶向PKM2的shRNA序列的物质。


7.一种靶向外泌体PKM2对非小细胞肺癌顺铂耐药性的影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建PKM2过表达的真核表达载体；
(2)用步骤(1)得到的PKM2过表达载体转染至对顺铂敏感的非小细胞肺癌细胞中并培养；
(3)收集步骤(2)得到的PKM2过表达的细胞系培养后的培养液，通过超速离心法纯化外泌体，得到PKM2过表达的外泌体；
(4)构建两条PKM2敲低的shRNA表达载体，并包装至慢病毒中；
(5)用步骤(4)得到的PKM2shRNA慢病毒感染至顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中并培养；
(6)收集步骤(5)得到的PKM2shRNA敲低的耐药细胞系培养后的培养液，通过超速离心法纯化外泌体，得到PKM2敲低的外泌体；
(7)利用步...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨浩，黄钢，王栋梁，解伟，张坤驰，孔平，梁蓓蓓，
申请(专利权)人：上海健康医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31