一种第四代CAR-T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种第四代CAR‑T细胞及其应用，所述第四代CAR‑T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、复合型IL‑6和CCL19；所述复合型IL‑6和CCL19为NFAT调控型过表达。本发明专利技术采用NFAT调控启动子调控T细胞对复合型IL‑6和CCL19的表达，在识别肿瘤抗原后表达分泌HIL‑6和CCL19，显著提高了CAR‑T细胞的增殖能力和抗肿瘤效果，同时规避了全身性或者局部的炎症反应，降低了CAR‑T的副作用。

【技术实现步骤摘要】
一种第四代CAR-T细胞及其应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种第四代CAR-T细胞及其应用，尤其涉及一种条件性过表达复合型IL-6和CCL19的第四代CAR-T细胞及其应用。
技术介绍
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(ChimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy，CAR-T)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，CAR-T细胞疗法已经广泛应用于治疗B细胞恶性肿瘤，靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。但是，CAR-T细胞疗法仍然存在多种问题。在白血病治疗方面，CAR-T细胞疗法存在复发率高的问题，促进CAR-T细胞的维持和记忆性T细胞的形成可能是解决该问题的技术突破口；此外，抗CD19的CAR-T细胞的临床治疗研究结果显示，患者对CAR-T细胞治疗的响应率与细胞因子释放综合征(CRS)的发生存在一定的正相关关系，而CRS又可能导致CAR-T细胞相关的脑病综合征(CRES)等副作用，严重限制了CAR-T细胞的临床应用；而在实体瘤治疗方面，CAR-T细胞疗效差，目前尚未报道相关的临床研究突破。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种第四代CAR-T细胞及其应用，通过条件性过表达复合型IL-6和CCL19，不仅提高了CAR-T抗肿瘤作用，而且降低了其在治疗过程中的副作用。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：<br>第一方面，本专利技术提供了一种第四代CAR-T细胞，所述第四代CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、复合型IL-6和CCL19；所述复合型IL-6和CCL19为NFAT调控型过表达。本专利技术中，采用NFAT调控启动子调控T细胞对复合型IL-6和CCL19的表达，当CAR-T细胞处于静息状态时，复合型IL-6和CCL19不表达，当CAR-T细胞识别肿瘤抗原被激活后，NFAT调控启动子5×NFAT-RE-minP启动对复合型IL-6和CCL19的转录和翻译，复合型IL-6和CCL19表达，复合型IL-6刺激CAR-T细胞增殖、记忆分化、增强杀伤效果，CCL19将外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部，两者相互配合共同实现对肿瘤的靶向促凋亡作用。优选地，所述复合型IL-6为IL-6和IL-6Rα的复合物，所述复合型IL-6(HIL-6)包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；SEQIDNO:1：PPEEPQLSCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYIVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPARGGGSGGGGSVEPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM。优选地，所述CCL19包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；SEQIDNO:2：MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS。优选地，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为Mesothelin。优选地，所述抗原结合结构域为靶向Mesothelin的单链抗体。优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域。优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2的组合。优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、Mesothelin抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成。优选地，所述嵌合抗原受体包括如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；SEQIDNO:3：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSGILEQQGIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。第二方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包括嵌合抗原受体编码基因、NFAT调控启动子、复合型IL-6编码基因和CCL19编码基因。优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述第四代CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、复合型IL-6和CCL19；/n所述复合型IL-6和CCL19为NFAT调控型过表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述第四代CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、复合型IL-6和CCL19；
所述复合型IL-6和CCL19为NFAT调控型过表达。


2.根据权利要求1所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述复合型IL-6为IL-6和IL-6Rα的复合物，所述复合型IL-6包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述CCL19包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；
优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为Mesothelin；
优选地，所述抗原结合结构域为靶向Mesothelin的单链抗体；
优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域；
优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2的组合；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。


4.根据权利要求1-3任一项所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、Mesothelin抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成；
优选地...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤朝阳，秦乐，吴迪，冯世忠，冯嘉昆，杨乐旋，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：广东昭泰体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44