一种工程化人体免疫细胞、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种工程化人体免疫细胞、其制备方法及应用。本发明专利技术所述工程化人体免疫细胞是通过重编程人T细胞诱导而成的免疫杀伤淋巴细胞，其保留衍生其的人T细胞的标志物和功能并具有NK细胞的标志物和功能，其中，所述人T细胞的重编程涉及BCL11B基因的缺失。与T细胞和NK细胞相比，所述工程化人体免疫细胞不仅具有更广谱的肿瘤抗原识别杀伤功能，而且还具有更广谱的病毒、细菌等微生物识别清除功能，并具有高效的体外扩增能力。

【技术实现步骤摘要】
一种工程化人体免疫细胞、其制备方法及应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种工程化人体免疫细胞、其制备方法及应用。
技术介绍
目前，免疫疗法已成为癌症治疗领域中最受关注和最有希望的“新”想法。2013年《科学》杂志评出的年度十大科学突破排行榜中，肿瘤免疫治疗高居榜首。诺华和凯特公司的嵌合抗原受体(CAR,ChimericAntigenReceptor)T细胞被美国FDA批准上市，肿瘤免疫细胞治疗在血液恶性癌症治疗领域取得了里程碑式进展。然而，肿瘤免疫细胞治疗仍然存在临床治疗的技术瓶颈，如基因修饰免疫细胞的靶点单一等原因导致肿瘤免疫逃逸，肿瘤复发；如实体肿瘤缺乏高效、低副作用的特异性标志物，目前的基因修饰免疫细胞治疗对实体肿瘤均未见高效、安全的临床疗效。T细胞根据其表面标志和功能的差异，可分为不同的亚群；如根据TCR类型差异可分为γδT细胞和αβT细胞。αβT细胞占T细胞95％以上，是体内具有T细胞分化标记、执行T细胞功能主要的细胞群，代表了T细胞的多样性。而γδT细胞是一群高度异质性细胞，其表面T细胞受体由γ链和δ链组成，其亚类种类多、表型多变、功能丰富，γδT细胞各亚类间生物学特性各异，在机体肿瘤、感染及自身免疫性疾病等的发生、发展中均有重要作用，被认为是机体连接天然免疫与适应性免疫功能的桥梁。像T细胞一样，自然杀伤(NK)细胞是人体免疫系统中不可或缺的一部分。NK细胞被认为是占外周血淋巴细胞约10-15％且在天然免疫响应中起关键作用的淋巴样细胞。与T细胞不同的是，NK细胞以MHC非限制性方式识别其靶标。NK细胞可呈现抗病毒作用、抗GvH作用和抗癌作用，具体地，NK细胞直接杀伤恶性肿瘤，包括肉瘤、骨髓瘤、癌、淋巴瘤和白血病，或有助于通过诱导树突状细胞(DC)活性或肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的适应性免疫活化，由此消除异常细胞，所述异常细胞为肿瘤细胞或正发展成为肿瘤细胞的细胞。尽管NK细胞具有作为对抗癌症或感染性疾病的治疗剂的潜力，但是正常人体内大多的NK细胞以休眠状态存在，且癌症患者内的NK细胞由于癌细胞的免疫逃逸机制缺少其功能。为将自然杀伤细胞实际应用为治疗剂，需要能够识别并破坏肿瘤细胞的活化的自然杀伤细胞，且由于体内的自然杀伤细胞数目有限，因此，获得足够数量的活化的自然杀伤细胞是非常重要的。细胞重编程(cellreprogramming)指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程。在疾病的免疫治疗领域，已有通过细胞重编程来实现免疫细胞的类型转化的相关报道。例如，美国格拉斯通研究所(GladstoneInstitutes)的丁胜博士曾报道，通过特定的重编程方法，将促炎的效应T细胞重编程为抗炎的调节性T细胞；这种重编程对于自身免疫性疾病的治疗意义重大，具体地，在自身免疫性疾病中，被过度激发的效应T细胞会对机体造成损害，将这些细胞转化为调节性T细胞有助于减少免疫系统的过度活跃，使其恢复平衡，从而根本上治疗疾病。目前，尚未见细胞重编程技术在人类肿瘤免疫治疗中的应用。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供了一种通过重编程工程化的人体免疫细胞、其制备方法及应用。本专利技术的工程化人体免疫细胞兼具T细胞和NK细胞的部分标志物和功能，同时表达NK细胞和T细胞的抗原识别杀伤受体，因而，比NK细胞和T细胞本身具有更广谱的肿瘤抗原识别杀伤功能；同时，相较于衍生其的人成熟T细胞，本专利技术的工程化人体免疫细胞扩增能力增强，抗肿瘤效果更好。在第一方面，本专利技术提过了通过重编程人T细胞诱导而成的免疫杀伤淋巴细胞(ITNK)，其保留衍生其的T细胞的标志物和功能并具有NK细胞的标志物和功能，其中，所述人T细胞的重编程涉及BCL11B基因的缺失。优选地，所述人T细胞为成熟的人T细胞或含有成熟人T细胞的细胞群；进一步优选地，所述成熟人T细胞或含有成熟人T细胞的细胞群来源于人体脐带血或外周血；进一步优选地，所述成熟人T细胞或含有成熟人T细胞的细胞群来源于多能干细胞、胚胎干细胞或脐带血干细胞分化获得的成熟T细胞或细胞群。优选地，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞表达功能性的TCR、CD3和NKp30。优选地，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞表达选自以下的NK细胞的标志物：CD11c、NKG2D和CD161。优选地，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞低表达或不表达PD-1、CTLA-4或FOXP3免疫抑制检查点。优选地，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞低表达或不表达NK相关标志物：CD127、CD16、KIRDL2、KIRDL3、NKG2A。优选地，相较于衍生其的T细胞，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞的NOTCH表达上调。优选地，相较于衍生其的T细胞，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞中，LEF1和TCF7转录因子表达下降，NOTCH、AP1、mTOR、ID2、TBX21和NFIL3表达上升。优选地，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞的TCR介导的信号转导增强；优选地，相较于衍生其的T细胞，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞的与TCR介导的信号转导相关的基因CSF2、FOS、MAPK12、MAP3K8、IFNγ、NFKBIA、MAPK11、IL-10和TEC的表达上调。优选地，相对于NK细胞，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞的T细胞识别和TCR信号转导增强，优选地，CD3、CD4、CD8、CD40LG的表达上调。优选地，相较于衍生其的T细胞，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞的NK杀伤毒性相关信号转导增强；优选地，相较于衍生其的T细胞，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞的与NK杀伤毒性相关信号转导相关的基因PRF1、CSF2、ICAM1、CD244、PLCG2、IFNG、FCER1G、GZMB、NCR2、NCR1、KIR2DL4和SYK的表达上调。在一个优选的具体实施方案中，所述重编程的免疫杀伤淋巴细胞包括CD8+NKp46hiNKp44+NKp30+、CD4+NKp30+和γδTCR+NKp46hiNKp44+NKp30+T细胞亚群。在一个优选的具体实施方案中，所述人T细胞为成熟人T细胞，并且重编程所述人成熟T细胞包括：1)激活成熟人T细胞；2)对步骤1)所得激活的成熟人T细胞实施BCL11B基因敲除；3)将步骤2)所得细胞用T细胞培养基进行培养。其中，步骤1)中，使用抗人CD3抗体、抗人CD28抗体和抗人CD2抗体进行激活；优选地，使用抗人CD3抗体、抗人CD28抗体和抗人CD2抗体的磁珠与人成熟T细胞以1:2混合孵育激活T细胞。其中，步骤2)中，使用CRISPR/CAS9技术进行BCL11B基因敲除；优选地，所述基因敲除的靶点在BCL11B基因的第二外显子和/或第三外显子处。其中，步骤3)中，所述T细胞培养基包含IL-2；优选地，不与OP9-DL1进行共培养。第二方面，本专利技术提供了一种制备上述第一方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过重编程人T细胞诱导而成的免疫杀伤淋巴细胞，其保留衍生其的人T细胞的标志物和功能并具有NK细胞的标志物和功能，其中，所述人T细胞的重编程涉及BCL11B基因的缺失。/n

【技术特征摘要】
1.一种通过重编程人T细胞诱导而成的免疫杀伤淋巴细胞，其保留衍生其的人T细胞的标志物和功能并具有NK细胞的标志物和功能，其中，所述人T细胞的重编程涉及BCL11B基因的缺失。


2.根据权利要求1所述的细胞，其中，所述人T细胞为成熟人T细胞或含有成熟人T细胞的细胞群；
优选地，所述成熟人T细胞或含有成熟人T细胞的细胞群来源于人体脐带血或外周血；
优选地，所述成熟人T细胞或含有成熟人T细胞的细胞群来源于多能干细胞、胚胎干细胞或脐带血干细胞分化获得的成熟T细胞或细胞群。


3.根据权利要求1或2所述的细胞，其表达功能性的TCR、CD3和NKp30。


4.根据权利要求1-3任一项所述的细胞，其表达选自以下的NK细胞的标志物：CD11c、NKG2D和CD161；
优选地，其低表达或不表达PD-1、CTLA-4或FOXP3免疫抑制检查点；
优选地，其低表达或不表达NK相关标志物：CD127、CD16、KIRDL2、KIRDL3、NKG2A。


5.根据权利要求1-4任一项所述的新型免疫杀伤淋巴细胞，其中，相较于衍生其的T细胞，NOTCH表达上调。


6.根据权利要求1-5任一项所述的细胞，其中，相较于衍生其的T细胞，LEF1和TCF7转录因子表达下降，NOTCH、AP1、ID2、TBX21和NFIL3表达上升。


7.根据权利要求1-6任一项所述的细胞，其中，其TCR介导的信号转导增强；
优选地，相较于衍生其的T细胞，其与TCR介导的信号转导相关的基因CSF2、FOS、MAPK12、MAP3K8、IFNγ、NFKBIA、MAPK11、IL-10和TEC的表达上调；
优选地，相对于NK细胞，其T细胞识别和TCR信号转导增强；优选地，CD3、CD4、CD8、CD40LG的表达上调。


8.根据权利要求1-7任一项所述的细胞，其中，相较于衍生其的T细胞，其NK杀伤毒性相关信号转导增强；
优选地，相较于衍生其的T细胞，其与NK杀伤毒性相关信号转导相关的基因PRF1、CSF2、ICAM1、CD244、PLCG2、IFNG、FCER1G、GZMB、NCR2、NCR1、KIR2DL4和SYK的表达上调。


9.根据权利要求1-8任一项所述的细胞，其包括CD8+NKp46+NKp44+NKp30+、CD4+NKp30+和γδTCR+NKp46+NKp44+NKp30+T细胞亚群。


10.根据权利要求1-9任一项所述的细胞，其中，所述人T细胞为成熟人T细胞，并且...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏，蒋治武，秦乐，廖芮，郑迪威，崔元彬，汤朝阳，林思妙，姚瑶，
申请(专利权)人：英基生物医药香港有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港;81