一种用于Treg细胞高效扩增的可降解细胞膜及其制备方法、应用技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种Treg细胞快速扩增的新方法。本发明专利技术还包括一种用于Treg细胞高效扩增的可降解细胞膜及其制备方法。本发明专利技术提供了一种用于扩增Treg细胞的细胞膜，该细胞膜表面表达IL‑15和CD40L蛋白；所述的细胞膜源自具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。本发明专利技术中使用的膜材料无菌无毒，可以直接用于Treg细胞，乃至将培养获得的Treg细胞植入体内。本发明专利技术制备的细胞膜可降解，为后续处理提供了便捷，降低了污染的概率。本发明专利技术为在短时间内获得大量的Treg细胞提供了新的途径和方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于Treg细胞高效扩增的可降解细胞膜及其制备方法、应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种Treg细胞（调节性T细胞，TRegulatory细胞)快速扩增的新方法。本专利技术还包括一种用于Treg细胞高效扩增的可降解细胞膜及其制备方法，和应用。
技术介绍
调节性T细胞(TRegulatory细胞，Treg细胞)，是一类与机体免疫平衡相关的细胞亚群，它们可以主动抑制普通T细胞的功能，维持免疫系统对自身成分的耐受，使机体保持免疫稳态。Treg细胞主要分布于人体的胸腺、外周血、淋巴器官及脐静脉血中，以表达Foxp3、CD25、CD4为细胞表型特征，在过去20年内的研究已经证实了类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮（SLE）、Ⅰ型糖尿病（T1D）等自身免疫疾病是由于自身的Treg细胞和效应T细胞（Teff）的失衡引起的。临床试验的数据表明，特别是由于nTreg细胞缺乏所致的器官特异性免疫病，可以通过重构Foxp3+nTreg细胞而达到治疗效果。临床实验证明小剂量IL-2的输注可使Treg细胞增殖而不引起效应T细胞扩增，临床上为了预防GvHD，通常通过体外扩增被供体者外周血单核细胞刺激过得Treg细胞，然后把这些Treg细胞和造血干细胞一同输入患者体内。Treg按其来源可分为天然产生的自然调节性T细胞（nTreg）和诱导产生的适应性调节性T细胞(aTreg或iTreg)。其中自然调节性T细胞主要为CD4+CD127lo/−CD25+的Treg细胞,约占外周血及脾脏CD4+T细胞的5%～10%,除表达CD4分子和CD25分子外，其特征标志为其高表达转录因子Foxp3；适应性调节性T细胞包括Tr1，Th3等细胞，是在小剂量抗原或免疫抑制性细胞因子诱导下由外周幼稚T细胞发育而成的，主要分泌IL-10和TGF-β发挥免疫负调控作用。在人体的外周血淋巴细胞中Treg占比1%至2%，由于Treg细胞的数量较少，并且体外扩增Treg细胞的效率一直很低，这对临床中使用Treg细胞治疗就带来了极大的不便和困难，因此开发一种可以快速高效的扩增Treg细胞的方法对于推广该疗法用于临床非常重要。
技术实现思路
本专利技术目的在于：提供一种在体外快速扩增Treg细胞，为一种细胞膜。本专利技术再一目的在于：提供上述细胞膜的制备方法。本专利技术的又一目的在于：提供一种所述细胞膜的使用方法，通过上述实验材料和方法实现Treg细胞的体外快速扩增，并且扩增获得的细胞能够正常、健康的持续生长。。本专利技术提供了一种Treg细胞快速扩增的方法，制备了一种细胞膜结构，可以表达在膜表面，营造了体内细胞扩增的三维环境，有利于Treg细胞的快速扩增。一方面,本专利技术提供了一种用于扩增Treg细胞的细胞膜，所述的细胞膜表面表达IL-15和CD40L蛋白。所述的细胞膜源自具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。例如，在本专利技术的一个优选实施例中，所述的细胞膜源自人K562细胞。所述的IL-15蛋白与跨膜蛋白连接，含有IL-15、连接物（linker）和跨膜蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。较好的，所述CD40L的氨基酸序列如SEQIDNO4所示。另一方面，本专利技术提供了所述的细胞膜的制备方法，包括：（1）制备IL-15和CD40L蛋白的表达质粒；（2）IL-15和CD40L蛋白的表达质粒转染细胞；（3）收集并破碎转染成功的细胞，获得细胞膜碎片。较好的，所述的转染通过电转实现。所述的IL-15和CD40L蛋白的表达质粒是表达独立的IL-15和CD40L蛋白的重组质粒。再一方面，本专利技术还提供了所述的细胞膜的应用，所述的细胞膜作为骨架或者基质，促进Treg细胞的体外生长。所述的应用包括以下步骤：S1，制备IL-15和CD40L蛋白的表达质粒；S2，IL-15和CD40L蛋白的表达质粒转染细胞；所述的细胞为具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞；S3，收集并破碎转染成功的细胞，获得细胞膜碎片；S4，将步骤S3获得的细胞膜碎片、IL-15和CD40L蛋白、加入培养Treg细胞的介质或者容器；细胞膜与IL-15和CD40L蛋白比例为1：2-2：1，摩尔比；S5，在上述容器或者介质中加入TREG细胞，TREG细胞的接种密度为104-5*106个/ml；换液，培养3-14天。较好的，IL-15和CD40L蛋白的表达质粒通过下述方法制备：获得编码IL-15和CD40L蛋白的核酸分子；在IL-15序列和/或CD40L序列末端连接连接物；将连接后的核酸分子构建入表达载体中；编码IL-15、连接物、跨膜蛋白核酸分子的序列如SEQIDNO1所示,编码CD40L蛋白的核酸分子的序列如SEQIDNO3所示。IL-15和CD40L蛋白的表达质粒可以是分别表达IL-15和CD40L蛋白的两个质粒，也可以是在一个质粒中表达独立的IL-15和CD40L两个蛋白。本专利技术制备出的可以在细胞膜表面高效表达的跨膜细胞因子的细胞膜材料，可以用于刺激Treg细胞的高效扩增。试验结果显示，K562细胞膜表达IL-15和CD40L蛋白的K562细胞膜扩增效率在7天内可以大于109，扩增效率超过10000倍。本专利技术的方法操作简便，成本低廉，有利于Treg细胞的快速扩增。该方法中使用的材料均为无菌无毒，可以直接用于Treg细胞，乃至将培养获得的Treg细胞植入体内。本专利技术制备的细胞膜可降解，为后续处理提供了便捷，降低了污染的概率。本专利技术为在短时间内获得大量的Treg细胞提供了新的途径和方法。附图说明图1是K562细胞膜法扩增Treg细胞的细胞扩增效率比较结果；可见，使用K562细胞膜后，Treg细胞的扩增效率提升了超过10000倍。具体实施方式本专利技术制备出的可以在细胞膜表面高效表达的跨膜细胞因子的细胞膜材料，可以用于刺激Treg细胞的高效扩增。实施例1IL-15和CD40L表达质粒的合成和构建,CD40属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员，广泛表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、Ｂ细胞、树突状细胞（DC）、巨噬细胞等免疫细胞及内皮细胞、血小板等非免疫细胞表面。其配体CD40L与CD40是一对互补的蛋白质分子，属于TNF超家族成员。CD40L与CD40相似，也广泛表达于许多免疫类细胞，提供Ｔ、Ｂ细胞活化所必需的协同刺激信号。CD40L与CD40分子结合后，能使膜CD40分子交联和配基化，继而使CD40分子多聚化，构成CD40信号传导的结构基础和始动因素。因此在本专利技术中选用CD40L分子作为扩增Treg细胞的元件。IL-15白介素15（IL-15）可以刺激T细胞增殖，诱导多种类型的免疫细胞的激活扩增，并且本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于扩增Treg细胞的细胞膜，其特征在于，所述细胞膜的表面表达IL-15和CD40L蛋白；/n所述的细胞膜源自具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系或者单核系的可辨识的祖细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增Treg细胞的细胞膜，其特征在于，所述细胞膜的表面表达IL-15和CD40L蛋白；
所述的细胞膜源自具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系或者单核系的可辨识的祖细胞。


2.根据权利要求1所述的细胞膜，其特征在于，所述的细胞膜源自人K562细胞。


3.根据权利要求1所述的细胞膜，其特征在于，所述IL-15与跨膜蛋白连接；含有IL-15、连接物和跨膜蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。


4.根据权利要求1所述的细胞膜，其特征在于，所述CD40L的氨基酸序列如SEQIDNO4所示。


5.一种促进Treg细胞生长的细胞膜材料，其特征在于，所述的细胞膜材料，包括细胞膜表达IL-15和CD40L蛋白、人类的细胞膜，和Treg细胞；
Treg细胞分布在所述的表达IL-15和CD40L蛋白的、人类的细胞膜周围；
所述的细胞膜源自具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系或者单核系的可辨识的祖细胞。


6.权利要求1所述的细胞膜的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
（1）制备IL-15和CD40L蛋白的表达质粒；
（2）IL-15和CD40L蛋白的表达质粒转染细胞；
（3）收集并破碎转染成功的细胞，获得细胞膜碎片；
所述的细胞为具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，梁辉，倪健，田静，李雪玲，沈琦，高昂，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31