本发明专利技术公开了一种靶向间皮素嵌合抗原受体免疫细胞的外泌体及其制备方法和应用，属于肿瘤免疫技术领域。通过将免疫细胞以特异性的间皮素抗原活化后，产生的外泌体进行进一步的分析、分离、纯化、富集，最终得到携带CAR的免疫细胞外泌体。本发明专利技术的外泌体能用于多种癌症的治疗，如乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等，且这种外泌体具有克服CAR细胞治疗的免疫炎症风暴等不良反应，增强了CAR的组织浸透能力，还具有保存和运输方便的优势，为相关疾病的治疗提供了新的策略。
【技术实现步骤摘要】
一种间皮素嵌合抗原受体外泌体、及其制备方法和应用
本专利技术属于肿瘤免疫学
，具体涉及一种靶向间皮素的嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor，CAR)免疫细胞来源的外泌体、该外泌体的制备方法以及该外泌体在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途。
技术介绍
肿瘤的传统治疗方法以手术治疗、化学治疗和放射性治疗为主，免疫治疗作为新型的治疗手段尤为令人关注。免疫治疗包括免疫检查点抗体治疗、单克隆抗体治疗、肿瘤疫苗和嵌合抗原受体细胞治疗等。嵌合型抗原受体修饰免疫细胞已经从肿瘤免疫的临床前模型快速进入到商品化应用阶段。它是将单克隆抗体技术与细胞信号转导技术结合，通过胞外单链抗体可变区片段识别肿瘤表面特异性抗原，绕过抗原提呈和MHC的限制直接攻击肿瘤细胞。目前，美国FDA已批准了Kymriah™(CTL019)、Yescarta疗法应用于急性白血病和淋巴瘤的治疗，其靶向治疗分化抗原19（clusterofdifferentiation19，CD19）阳性的B细胞白血病和淋巴瘤总缓解率大于80%(JuneCH,O'ConnorRS,KawalekarOU,GhassemiS,MiloneMC:CARTcellimmunotherapyforhumancancer.Science2018,359(6382):1361-1365；JuneCH,SadelainM:ChimericAntigenReceptorTherapy.TheNewEnglandjournalofmedicine2018,379(1):64-73)，显示出了清除肿瘤细胞的潜力。间皮素是一种锚定在细胞膜上的糖蛋白，通过激活NF-κB、MAPK和PI3K等信号通路调控肿瘤的生长和转移。研究表明，间皮素在多种肿瘤组织中异常表达，包括乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等(MorelloA,SadelainM,AdusumilliPS:Mesothelin-TargetedCARs:DrivingTCellstoSolidTumors.Cancerdiscovery2016,6(2):133-146；RafiqS,YekuOO,JacksonHJ,PurdonTJ,vanLeeuwenDG,DrakesDJ,SongM,MieleMM,LiZ,WangPetal:TargeteddeliveryofaPD-1-blockingscFvbyCAR-Tcellsenhancesanti-tumorefficacyinvivo.Naturebiotechnology2018,36(9):847-856；SacksteinR,SchattonT,BarthelSR:T-lymphocytehoming:anunderappreciatedyetcriticalhurdleforsuccessfulcancerimmunotherapy.Laboratoryinvestigation;ajournaloftechnicalmethodsandpathology2017,97(6):669-697)，且与不良预后相关。因此，间皮素是一种非常有希望的治疗靶点。细胞、包括免疫细胞能分泌大量的外泌体(exosome)，有研究发现，CAR-T细胞可以分泌表达带有CAR分子的外泌体，其通过包裹的穿孔素、颗粒酶、溶酶体酶等直接靶向杀伤特异靶点阳性的肿瘤细胞（FuW,LeiC,LiuS,CuiY,WangC,QianK,LiT,ShenY,FanX,LinFetal:CARexosomesderivedfromeffectorCAR-Tcellshavepotentantitumoureffectsandlowtoxicity.Naturecommunications2019,10(1):4355）。但目前尚未见到靶向间皮素的CAR免疫细胞来源的外泌体及其治疗疾病有效的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种靶向间皮素的嵌合抗原受体（ChimericAntigenReceptor，CAR）免疫细胞来源的外泌体（后述为“间皮素嵌合抗原受体外泌体”或“间皮素CAR外泌体”）、其制备方法及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。专利技术人发现使用靶向间皮素的CAR-T细胞，使其对特定的抗原活化，再对其分泌的外泌体进行纯化、富集，以制备特定的携带有CAR蛋白的外泌体。该种外泌体有非常强的抗肿瘤作用，另外由于外泌体的膜性结构，还可以进一步对其进行工程改造，如包裹药物、抗体等。该外泌体可以实现肿瘤等疾病的治疗，对于新的肿瘤治疗方法而言具有重要意义。并且，这种外泌体具有克服CAR细胞治疗的免疫炎症风暴等不良反应、增强CAR的组织浸透能力的优点，还具有保存和运输方便的优势，为相关疾病的治疗提供了新的策略。本专利技术的第一方面，提供一种间皮素CAR外泌体，其中，所述外泌体包含靶向间皮素的部分，所述靶向间皮素的部分的氨基酸序列为SEQIDNO.1。本专利技术的第二方面，提供制备上述的间皮素CAR外泌体的方法，其中，所述方法包括：（1）通过分离和培养，得到免疫细胞；（2）采用包含或表达间皮素的活化剂，对所述免疫细胞进行抗原特异性活化并进行培养，得到CAR免疫细胞；（3）从所述CAR免疫细胞的培养上清中收集包含CAR免疫细胞外泌体的沉淀物；（4）对所述沉淀物进行纯化和富集，得到纯化后的间皮素CAR外泌体。本专利技术的第三方面，提供一种包含上述的间皮素CAR外泌体的药物组合物或抗体偶联物。本专利技术的第四方面，提供一种如上所述的间皮素CAR外泌体、包含其的药物组合物或抗体偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。附图说明图1为电子显微镜下重组间皮素蛋白活化的CAR-T来源的CAR外泌体形态。图2为电子显微镜下重组间皮素蛋白活化的CAR-T来源的CAR外泌体粒径大小。图3为ELISA检测外泌体表面CAR与抗原结合的检测结果。图4为CAR-T来源的CAR外泌体显著杀伤过表达间皮素MDA-231-MSLN细胞的检测结果。除非另有定义，否则本文使用的科技术语具有与本专利技术所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。参见例如Singleton等，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2nded.，J.Wiley&Sons（NewYork，NY1994）；Sambrook等，MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringsHarborPress（ColdSpringsHarbor，NY1989）。本领域技术人员将认识到可用于实施本专利技术的、与本文描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料。实际上，本专利技术并不限于本文所描述的方法和材料，而是可基于本专利技术的精神，进行各种常规调整或修改，并且调整或修改后的方案仍落入了本专利技术的保护范围之内。除非上下文明确地指出，否则本文所使用的术语“一个”和“一种”等涵盖了复数的对象。在本文中，通过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种间皮素CAR外泌体，其中，所述外泌体包含靶向间皮素的部分，所述靶向间皮素的部分的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1；/n优选地，所述外泌体具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。/n
【技术特征摘要】
1.一种间皮素CAR外泌体，其中，所述外泌体包含靶向间皮素的部分，所述靶向间皮素的部分的氨基酸序列为SEQIDNO.1；
优选地，所述外泌体具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。
2.一种制备权利要求1所述的间皮素CAR外泌体的方法，其中，所述方法包括：
（1）通过分离和培养，得到免疫细胞；
（2）采用包含或表达间皮素的活化剂，对所述免疫细胞进行抗原特异性活化并进行培养，得到CAR免疫细胞；
（3）从所述CAR免疫细胞的培养上清中收集包含CAR免疫细胞外泌体的沉淀物；
（4）对所述沉淀物进行纯化和富集，得到纯化后的间皮素CAR外泌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞是T细胞或NK细胞；
优选地，所述免疫细胞来源于健康志愿者血液；
优选地，所述免疫细胞为T细胞，并且按照以下步骤制备所述免疫细胞：
a）从受试者外周血中分离PBMC，在磁珠的存在下分离和激活T细胞；
b）将所述T细胞在用补充有白细胞介素的基本培养基进行培养和扩增，得到所述免疫细胞。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，通过如下进行所述抗原特异性活化：向所述免疫细胞的培养体系中加入所述抗原或固化的所述抗原或表达所述抗原的病毒颗粒、或者将所述免疫细胞和表达所述抗原的灭活后的工程细胞共培育、或者将所述免疫细胞和表达所述抗原的灭活后肿瘤细胞共培育；
优选地，所述的活化剂为间皮素重组蛋白、磁珠交联的间皮素重组蛋白、表达间皮素的MDA-MB-231细胞、表达间皮素的病毒颗粒；更优选地，所述的活化剂为间皮素重组蛋白；
优选地，通过如下进行所述抗原特异性活化：将编码间皮素重组蛋白的核酸序列插入慢病毒载体中，然后转染宿主细胞进行扩增，将得到的表达有所述间皮素重组蛋白的病毒颗粒转染T细胞；
优选地，所述CAR免疫细胞为CAR-T细胞。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，通过如下方法制备所述包含CAR免疫细胞外泌体的沉淀物：将所述培养上清于200-500g下离心3-8分钟，以去除死细胞和大的碎片，得到初步离心的上清液；将所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨鹏翔，接晶，杨宇民，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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