包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块及其制备方法技术

包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)～(3)，步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，步骤(2)，在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养所述步骤(1)中得到的细胞聚集体，步骤(3)，将所述步骤(2)中得到的细胞聚集体进行悬浮培养，得到所述细胞团块，其中，该步骤(3)包含选自由下列步骤组成的组中的至少一个步骤：步骤(3a)，在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，步骤(3b)，在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，及步骤(3c)，在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行培养。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块及其制备方法
本专利技术涉及在体外的包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块，及其制备方法。进一步，涉及包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块，其中，在细胞团块中同时包含神经系统细胞和非神经上皮组织。
技术介绍
在IntJClinExpPathol2017；10(7)：8072-8081(非专利文献1)中报告，通过将由小鼠iPS细胞形成的胚状体与由小鼠收集的嗅上皮或嗅球的初代培养细胞进行共培养，诱导分化为一部分表达嗅神经细胞标记的神经细胞。现有技术文献非专利文献非专利文献1：IntJClinExpPathol2017；10(7)：8072-8081专利技术概述专利技术要解决的问题本专利技术的目的在于提供由多潜能干细胞有效地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的办法。尤其是提供有效地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的办法，其以无饲养细胞培养的多潜能干细胞作为起始材料，且不使用从生物体分离的嗅上皮或嗅球的初代培养细胞。用于解决问题的手段本专利技术人在为解决上述问题进行反复研究时，发现通过将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，一次添加BMP信号转导途径作用物质并培养给定时期后，进一步添加FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质中的至少一种，可有效地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。此外，通过将BMP信号转导途径作用物质，FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的添加条件最优化，从而将最适添加时期确定为将BMP信号转导途径作用物质在从多潜能干细胞的悬浮培养开始起72小时以内添加，接着将FGF信号转导途径作用物质或者BMP信号转导途径抑制物质在从BMP信号转导途径作用物质的添加起96小时以内添加，由此成功地更有效地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。此外发现，通过将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，利用选自由TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonichedgehog信号转导途径作用物质组成的组中的至少1个进行前培养，从而能够改善包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备效率。即，本专利技术涉及以下例示的内容。[1]包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)～(3)，步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，步骤(2)，在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养上述步骤(1)中得到的细胞聚集体，步骤(3)，将上述步骤(2)中得到的细胞聚集体进行悬浮培养，而得到上述细胞团块，其中，该步骤(3)包含选自由下列步骤组成的组中的至少一个步骤，步骤(3a)，在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，步骤(3b)，在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，及步骤(3c)，在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养。[2]根据[1]所述的制备方法，其中，上述步骤(3)包含上述步骤(3a)，在上述步骤(3a)后进一步包含上述步骤(3c)。[3]根据[1]或[2]所述的制备方法，其中，在上述步骤(1)中，上述多潜能干细胞分散为单一细胞。[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3)包含上述步骤(3b)或上述步骤(3c)，在上述步骤(3b)或上述步骤(3c)后进一步包含在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养的步骤(3d)。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3)中，还存在EGF信号转导途径作用物质。[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(1)前，进一步包含步骤(a)，所述步骤(a)为将上述多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonichedgehog信号转导途径作用物质中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养的步骤。[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(2)的开始时期为从上述步骤(1)的多潜能干细胞的悬浮培养开始起0.5小时以后到72小时以内。[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(2)的开始时期为上述步骤(1)中形成的上述细胞聚集体的表层中，有1成以上的细胞互相形成紧密连接的时期。[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质包含选自由BMP2，BMP4，BMP7，BMP13及GDF7组成的组中的至少1个蛋白质。[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质包含BMP4，在上述BMP4的浓度为25pM～5nM的培养基中开始上述步骤(2)的培养。[11]根据[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3)包含选自由上述步骤(3a)及上述步骤(3c)组成的组中的至少1个步骤，上述FGF信号转导途径作用物质包含选自由FGF2及FGF8，以及它们的变体组成的组中的至少一种。[12]根据[1]～[11]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3)的开始时期为从添加上述步骤(2)的BMP信号转导途径作用物质起12小时以后到72小时以内。[13]根据[1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，在选自由上述步骤(2)及上述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中，存在上述第一Wnt信号转导途径抑制物质。[14]根据[1]～[13]中任一项所述的制备方法，其中，上述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含具有对于非经典的Wnt途径的抑制活性的物质。[15]根据[1]～[14]中任一项所述的制备方法，其中，上述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含PORCN抑制剂。[16]根据[15]所述的制备方法，其中，上述PORCN抑制剂包含选自由IWP-2，IWP-3，IWP-4，IWP-L6，IWP-12，LGK-974，Wnt-C59，ETC-159及GNF-6231组成的组中的至少一种。[17]根据[15]或[16]所述的制备方法，其中，上述PORCN抑制剂包含IWP-2，在上述IWP-2的浓度为10nM～50μM的培养基中开始上述步骤(1)的培养。[18]根据[1]～[17]中任一项所述的制备方法，其中，上述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含选自由KY02111及KY03-I组成的组中的至少一种。[19]根据[1]～[18]中任一项所述的制备方法，其中，上述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含KY02111，在上述KY02111的浓度为10nM～50μM的培养基中开始上述步骤(1)的培养。[20]根据[1]～[19]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3)包含选自由上述步骤(3b)及上述步骤(3c)中的至少1个步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)～(3)：/n步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，/n步骤(2)，在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养所述步骤(1)中得到的细胞聚集体，/n步骤(3)，将所述步骤(2)中得到的细胞聚集体进行悬浮培养，得到所述细胞团块，/n其中，该步骤(3)包含选自由下列步骤组成的组中的至少一个步骤，/n步骤(3a)，在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，/n步骤(3b)，在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，及/n步骤(3c)，在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180824 JP 2018-1576531.包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)～(3)：
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养所述步骤(1)中得到的细胞聚集体，
步骤(3)，将所述步骤(2)中得到的细胞聚集体进行悬浮培养，得到所述细胞团块，
其中，该步骤(3)包含选自由下列步骤组成的组中的至少一个步骤，
步骤(3a)，在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，
步骤(3b)，在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，及
步骤(3c)，在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(3)包含所述步骤(3a)，且在所述步骤(3a)后进一步包含所述步骤(3c)。


3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤(3)包含所述步骤(3b)或所述步骤(3c)，且在所述步骤(3b)或所述步骤(3c)后，进一步包含在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养的步骤(3d)。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(3)中，还存在EGF信号转导途径作用物质。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(1)前进一步包含步骤(a)，所述步骤(a)为将所述多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自由TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonichedgehog信号转导途径作用物质组成的组中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养的步骤。


6.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其中，所述BMP信号转导途径作用物质包含选自由BMP2，BMP4，BMP7，BMP13及GDF7组成的组中的至少1个蛋白质。


7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(3)包含选自由所述步骤(3a)及所述步骤(3c)组成的组中的至少1个步骤，且所述FGF信号转导途径作用物质包含选自由FGF2及FGF8，以及它们的变体组成的组中的至少一种。


8.根据权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(3)的开始时期为从添加所述步骤(2)的BMP信号转导途径作用物质起12小时以后到72小时以内。


9.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中，在选自由所述步骤(2)及所述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中，存在所述第一Wnt信号转导途径抑制物质。


10.根据权利要求1～9中任一项所述的制备方法，其中，所述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含具有对于非经典的Wnt途径的抑制活性的物质。


11.根据权利要求1～10中任一项所述的制备方法，其中，所述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含PORCN抑制剂。


12.根据权利要求1～11中任一项所述的制备方法，其中，所述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含选自由KY02111及KY03-I组成的组中的至少一种。


13.根据权利要求1～12中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(3)包含选自由所述步骤(3b)及所述步骤(3c)组成的组中的至少1个步骤，且所述BMP信号转导途径抑制物质包含I型BMP受体抑制剂。


14.根据权利要求1～13中任一项所述的制备方法，其中，在选自由所述步骤(1)，所述步骤(2)及所述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中还存在TGFβ信号转导途径抑制物质。


15.根据权利要求14所述的制备方法，其中，所述TGFβ信号转导途径抑制物质包含Alk5/TGFβR1抑制剂。


16.根据权利要求1～15中任一项所述的制备方法，其中，在选自由所述步骤(1)，所述步骤(2)及所述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中还存在Wnt信号转导途径作用物质。


17.根据权利要求16所述的制备方法，其中，所述Wnt信号转导途径作用物质作用于所述第一Wnt信号转导途径抑制物质的作用点的下游的信号转导因子。


18.根据权利要求16或17所述的制备方法，其中，所述Wnt信号转导途径作用物质包含使Wnt经典途径活化的物质。


19.根据权利要求18所述的制备方法，其中，所述使Wnt经典途径活化的物质抑制β连环蛋白的分解或促进β连环蛋白的稳定。


20.根据权利要求16～19中任一项所述的制备方法，其中，所述Wnt信号转导途径作用物质包含GSK3抑制剂。


21.根据权利要求16～20中任一项所述的制备方法，其中，所述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含PORCN抑制剂，所述Wnt信号转导途径作用物质包含GSK3抑制剂。


22.根据权利要求1～21中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(3)中还存在TAK1抑制物质。


23.根据权利要求1～22中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(3)在...

【专利技术属性】
技术研发人员：中野德重，
申请(专利权)人：住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP