一种重编程NK细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种重编程NK细胞的培养方法，所述方法包括：构建表达膜固定IL‑12和CD19的人工抗原呈递细胞，将重编程NK细胞与所述人工抗原呈递细胞共培养，所述重编程NK细胞通过将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞制备得到。本发明专利技术采用采用表达膜固定IL‑12和CD19的人工抗原呈递细胞培养重编程NK细胞，对重编程NK细胞具有活化作用，显著提高了重编程NK细胞的数量和扩增效率，增强了重编程NK细胞的肿瘤杀伤活性。

【技术实现步骤摘要】
一种重编程NK细胞的培养方法
本专利技术属于生物
，涉及一种重编程NK细胞的培养方法。
技术介绍
基于CRISPR/Cas9技术将T细胞重编程成为NK细胞，有利于克服主要组织相容性复合体(MHC)对T细胞的限制性，已成为细胞免疫治疗领域的研究热点。重编程NK细胞具有T细胞和NK细胞的双重功能，相较于T细胞或NK细胞具有显著提高的肿瘤杀伤功能，在癌症治疗中展现出了巨大的潜力。将重编程NK细胞应用于免疫治疗的一大障碍是难以生产大量功能完全的重编程NK细胞，同时缺少体外扩增重编程NK细胞的标准方法。目前常用的NK细胞的培养方法包括血液细胞分离法、细胞因子或化学药品刺激法和饲养细胞法，但是这些方法普遍存在着操作繁琐、成本高、周期长、数量无法满足需求的问题，且不十分适用于重编程NK细胞的培养。因此，有必要根据重编程NK细胞的特有属性，建立一种简单高效的培养方法，以期在短期内获得大量的重编程NK细胞。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种重编程NK细胞的培养方法，所述方法采用表达膜固定IL-12和CD19的人工抗原呈递细胞培养重编程NK细胞，显著提高了重编程NK细胞的数量和扩增效率，增强了重编程NK细胞的肿瘤杀伤活性。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种重编程NK细胞的培养方法，所述方法包括：构建表达膜固定IL-12和CD19的人工抗原呈递细胞，将重编程NK细胞与所述人工抗原呈递细胞共培养。本专利技术中，将IL-12和CD19表达于哺乳动物细胞表面构建人工抗原呈递细胞，通过与重编程NK细胞表面的受体结合用于活化重编程NK细胞，显著提高了重编程NK细胞的扩增数量，并促进了重编程NK细胞的肿瘤细胞毒性。优选地，所述IL-12包括IL-12A和IL-12B，所述IL-12通过IL-12B与CD8α跨膜区形成融合蛋白、表达在所述人工抗原递呈细胞表面。优选地，所述IL-12A包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；SEQIDNO:1：MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRA。优选地，所述IL-12B包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；SEQIDNO:2：MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYY。优选地，所述CD19包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；SEQIDNO:3：MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHL。优选地，所述CD8α跨膜区包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；SEQIDNO:4：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。优选地，所述人工抗原呈递细胞的构建方法包括：构建包括IL-12A编码基因、IL-12B和CD8α跨膜区融合蛋白编码基因或CD19编码基因中的任意一种或至少两种的组合的慢病毒载体，利用慢病毒系统将IL-12A编码基因、IL-12B和CD8α跨膜区融合蛋白编码基因和CD19编码基因导入K562细胞。优选地，所述重编程NK细胞的制备方法包括：将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞，得到重编程NK细胞，其中，所述RNP复合物包括靶向Bcl11b基因的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。优选地，所述crRNA包括SEQIDNO:5所示的核酸序列；SEQIDNO:5：gaagcagtgtggcggcagctgttttagagcta。优选地，所述tracrRNA包括SEQIDNO:6所示的核酸序列；SEQIDNO:6：tagcaagttaaaataaggctagtcatttatcacattgaaaatctggcaccgagtcggtg。优选地，所述电转的电压为800～2500V，例如可以是800V、900V、1000V、1100V、1200V、1300V、1400V、1500V、1600V、1700V、1800V、1900V、2000V、2100V、2200V、2300V、2400V或2500V。优选地，所述重编程NK细胞与所述人工抗原递呈细胞的数量比为(0.25～1):1，例如可以是0.25:1、0.3:1、0.35:1、0.4:1、0.45:1、0.5:1、0.55:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.85:1、0.9:1、0.95:1或1:1。优选地，所述共培养的时间为3～14天，例如可以是3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天。优选地，所述方法还包括对共培养的重编程NK细胞与人工抗原递呈细胞进行辐照的步骤。优选地，所述辐照的剂量为50～500Gy，例如可以是50Gy、100Gy、150Gy、200Gy、250Gy、300Gy、350Gy、400Gy、450Gy或500Gy。作为优选技术方案，本专利技术提供了一种重编程NK细胞的培养方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建包括IL-12A编码基因、IL-12B和CD8α跨膜区融合蛋白编码本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重编程NK细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：/n构建表达膜固定IL-12和CD19的人工抗原呈递细胞，将重编程NK细胞与所述人工抗原呈递细胞共培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种重编程NK细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：
构建表达膜固定IL-12和CD19的人工抗原呈递细胞，将重编程NK细胞与所述人工抗原呈递细胞共培养。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IL-12包括IL-12A和IL-12B，所述IL-12通过IL-12B与CD8α跨膜区形成融合蛋白、表达在所述人工抗原递呈细胞表面；
优选地，所述IL-12A包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述IL-12B包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述CD19包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述CD8α跨膜区包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述人工抗原呈递细胞的构建方法包括：
构建包括IL-12A编码基因、IL-12B和CD8α跨膜区融合蛋白编码基因或CD19编码基因中的任意一种或至少两种的组合的慢病毒载体，利用慢病毒系统将IL-12A编码基因、IL-12B和CD8α跨膜区融合蛋白编码基因和CD19编码基因导入K562细胞。


4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述重编程NK细胞的制备方法包括：将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞，得到重编程NK细胞，其中，所述RNP复合物包括靶向Bcl11b基因的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述crRNA包括SEQIDNO:5所示的核酸序列；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤朝阳，秦乐，吴迪，冯世忠，冯嘉昆，杨乐旋，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：广东昭泰体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44