一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法，在三维混合培养基条件下，提供合适的细胞接种密度及MSX加压浓度，使其在短时间内能得到较多的阳性率高的细胞池。所述的三维混合培养基由三种基础培养基CD Fusion，CHO Cloning Medium，GrowthA按比例组成。本发明专利技术提供的方法能够显著提高细胞池克隆率，显著降低筛选周期，具有较好的实际应用意义。

【技术实现步骤摘要】
一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法。
技术介绍
随着生物技术的发展，抗体、疫苗的表达和生产在生物制药中占据着重要地位，细胞株筛选可获得稳定高产的细胞株，稳转细胞株的构建是表达抗体疫苗的重要手段之一。目前细胞株筛选流程主要为：构建表达质粒，宿主细胞转染，细胞池加压筛选，单克隆筛选，获得高表达细胞株。Merck的CHO-K1表达系统，在细胞筛选时时添加谷氨酸合成酶(glutaminesythetase，GS)抑制剂氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulfoximine，MSX)，使GS基因及与之相连的目的基因一起扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。从而大大提高了转染的效率和阳性克隆的筛选率。评估高表达细胞株的主要指标有蛋白表达量、蛋白质质量、细胞稳定性，这些指标与筛选出的细胞池密切相关。常规细胞池筛选方法为宿主细胞转入质粒后，进行多轮加压筛选，经过漫长的加压筛选后以获得高表达细胞池。目前CHO-K1存在着细胞池筛选生长缓慢，克隆形成率低，阳性率低等问题，这严重的影响了稳转细胞株筛选的进程。因此如何利用工艺提高稳转细胞株细胞池的克隆率，缩短筛选时间，提高筛选通量，是亟需解决的问题。中国专利201910831248.5中公开了一种NDUFS3基因敲低和/或过表达的稳转株及其构建方法，其中通过将目的基因导入细胞株，采用8-10μg/mL嘌呤霉素对转染后的细胞株进行至少一次筛选，得到NDUFS3基因敲低和/或过表达的稳转株。该方法方法操作简单、用时短、转染率高，但更适用于NDUFS3基因敲低和/或过表达的A875细胞、A375细胞和/或SK-MEL-110细胞。中国专利201610173410.5公开了一种GS表达系统细胞株的高通量筛选方法，其中包括在25-100μM氨基亚砜蛋氨酸加压后，选择细胞活力在25％-35％的细胞池进行单克隆化筛选。其中GS表达系统为携带GS基因的并且GS基因下游插入了外源基因的表达载体转染至NS0细胞或者敲除了GS基因的CHO细胞。但该筛选步骤中选用的是半固体培养基，与细胞悬液混匀时操作不便，有待进一步改进。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法。首先，本申请优化了培养稳转细胞的培养基，由传统培养基优化为混合三维培养基；其次，本申请优化了包括细胞接种密度及MSX加压浓度在内的培养条件。根据本申请提供的方法，可以显著提高稳转细胞株细胞池的形成率。一方面，本专利技术提供了一种用于稳转细胞株培养中细胞池加压筛选的混合三维培养基。所述的培养基由三种基础培养基CDFusion，CHOCloningMedium，GrowthA组成。所述的培养基为L1-L10中的一种，L1-L10中各基础培养基的组成比例如表1所示。表1.改良培养基组成成分表CDFusionCHOCloningMediumGrowthAL1100L20.500.5L30.750.250L40.50.50L50.50.250.25L60.7500.25L70.670.1650.165L80.80.10.1L90.60.30.1L100.60.10.3在一些实施例中，所述的CDCHOFusion为EX-CELL®CDCHOFusion，购自Sigma，货号为24365C；所述的CHOCloningMedium为ExcellCHOCloningMedium，购自Sigma，货号为C6366；所述的GrowthA为BalanCDCHOGrowthA，购自Irvine，货号为91128。优选地，所述的培养基为L3。优选地，所述的稳转细胞株为CHO-K1。另一方面，本专利技术提供了一种提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法。所述的稳转细胞株在细胞池加压筛选时采用前述混合三维培养基进行培养。所述的培养过程中，培养基筛选压力（MSX）为10-50μM。所述的培养过程中，铺板细胞密度为5000-20000个/孔。所述的培养过程中对混合培养基、铺板细胞密度、培养基筛选压力进行DOE设计如表2所示。表2.混合培养基/铺板细胞密度/培养基筛选压力DOE分组表格Cells（个/孔）MSX（uM）Basal12000010L12500025L131000050L141000010L105500025L1062000050L107500010L281000025L292000050L2101000010L3112000025L312500050L313500010L4141000025L4152000050L416500010L5171000025L5182000050L5191000010L6202000025L621500050L622500010L7232000025L7241000050L7252000010L8261000025L827500050L8282000010L9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于稳转细胞株培养中细胞池加压筛选的混合三维培养基，其特征在于，所述的培养基由三种基础培养基CD Fusion，CHO Cloning Medium，GrowthA组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于稳转细胞株培养中细胞池加压筛选的混合三维培养基，其特征在于，所述的培养基由三种基础培养基CDFusion，CHOCloningMedium，GrowthA组成。


2.根据权利要求1所述的混合三维培养基，其特征在于，所述的培养基为L2-L3、L5-L10中的一种，L2-L3、L5-L10中各基础培养基的组成比例如下：











CDFusion
CHOCloningMedium
GrowthA


L2
0.5
0
0.5


L3
0.75
0.25
0


L5
0.5
0.25
0.25


L6
0.75
0
0.25


L7
0.67
0.165
0.165


L8
0.8
0.1
0.1


L9
0.6
0.3
0.1


L10
0.6
0.1
0.3






。


3.根据权利要求2所述的混合三维培养基，其特征在于，所述的培养基为L3。


4.一种提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法，其特征在于，所述的稳转细胞株在采用权利要求1-3中任一项所述的混合三维培养基进行培养。


5.根据权利要求4所述的提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法，其特征在于，所述的培养过程中，培养基筛选压力为10-50μM。


6.根据权利要求5所述的提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法，其特征在于，所述的培养过程中，铺板细胞密度为5000-20000个/孔。


7.根据权利要求6所述的提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法，其特征在于，所述的培养过程中对混合培养基、铺板细胞密度、培养基筛选压力进行DOE设计如下：











Cells（个/孔）
MSX（μM）
Basal


1
20000
10
L1


2
5000
25
L1


3
10000
50
L1


4
10000
10
L10


5
5000
25
L10


6
20000
50
L10


7
5000
10
L2


8
10000
25
L2


9
20000
50
L2


10
10000
10
L3


11
20000...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓旺，陶佳林，董艳秋，周义千，王永忠，
申请(专利权)人：苏桥生物苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32