一种表达免疫调控因子的CAR-T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种表达免疫调控因子的CAR‑T细胞及其应用，所述CAR‑T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌性IL‑7和条件性CCL19；所述IL‑7的信号肽为IFN‑γ信号肽；所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。本发明专利技术的CAR‑T细胞表达免疫调控因子分泌性IL‑7和条件性CCL19，增强了CAR‑T的增殖能力，使得CAR‑T最大程度招募免疫细胞到肿瘤内部，提高了CAR‑T细胞的抗肿瘤效率。

【技术实现步骤摘要】
一种表达免疫调控因子的CAR-T细胞及其应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种表达免疫调控因子的CAR-T细胞及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor，CAR)是将识别肿瘤抗原的单链抗体与诱导T细胞活化的信号转导区融合而得到的嵌合型蛋白。向T细胞中导入编码CAR的基因，使得CAR-T细胞在膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的CAR分子，诱导T细胞活化，以不依赖于主要组织相容性基因复合体的方式实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。目前，CAR-T疗法在白血病、淋巴瘤等造血系统恶性肿瘤中取得了巨大突破，但是，在实体瘤的治疗上仍然没有比较好的效果。科研人员通过对CAR-T疗法进行改进和优化，提高CAR-T对实体瘤的治疗效果。CN109504660A公开了一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用，所述CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，其中，胞膜外抗原结合区以Nectin-4抗原的两个空间表位为靶点，细胞因子信号区为IL7和CCL19，但是存在外源IL-7蛋白无法分泌到T细胞外、CCL19的持续性分泌无法最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部的问题。因此，构建一种新型CAR-T细胞，不仅能转录翻译外源IL-7蛋白还能将IL-7分泌到T细胞外，而且能避免副反应、提高治疗安全性，在肿瘤的治疗领域具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种表达免疫调控因子的CAR-T细胞及其应用，所述嵌合抗原受体T细胞能够将IL-7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，同时规避了由于持续性分泌CCL19导致非肿瘤组织环境过多募集免疫细胞可能引起的炎症副反应。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种表达免疫调控因子的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌性IL-7和条件性CCL19；所述IL-7的信号肽为IFN-γ信号肽；所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。本专利技术中，将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IFN-γ的信号肽，采用NFAT调控型启动子作为CCL19编码基因的启动子，实现了CAR-T细胞对IL-7的分泌性表达和对CCL19的条件性表达。优选地，所述IFN-γ信号肽包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；SEQIDNO:1：MKYTSYILAFQLCIVLGSLG。优选地，所述IL-7包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；SEQIDNO:2：DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH。优选地，所述CCL19包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；SEQIDNO:3：MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS。优选地，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为GPC3。优选地，所述抗原结合结构域为靶向GPC3的单链抗体。优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD8α跨膜结构域。优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB和CD3ζ的组合。优选地，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗GPC3单链抗体、CD8α跨膜结构域、4-1BB和CD3ζ串联组成。优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；SEQIDNO:4：MALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。第二方面，本专利技术提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括IFN-γ信号肽编码基因、IL-7编码基因、NFAT调控启动子和CCL19编码基因。优选地，所述IFN-γ信号肽编码基因包括SEQIDNO:5所示的核酸序列；SEQIDNO:5：atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggc。优选地，所述IL-7编码基因包括SEQIDNO:6所示的核酸序列；SEQIDNO:6：gattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagt本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达免疫调控因子的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌性IL-7和条件性CCL19；/n所述IL-7的信号肽为IFN-γ信号肽；/n所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达免疫调控因子的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌性IL-7和条件性CCL19；
所述IL-7的信号肽为IFN-γ信号肽；
所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。


2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述IFN-γ信号肽包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述IL-7包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述CCL19包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；
优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽；
优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为GPC3；
优选地，所述抗原结合结构域为靶向GPC3的单链抗体；
优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD8α跨膜结构域；
优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB和CD3ζ的组合。


4.根据权利要求1-3任一项所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗GPC3单链抗体、CD8α跨膜结构域、4-1BB和CD3ζ串联组...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤朝阳，秦乐，吴迪，魏志辉，王翠花，王艳艳，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：广东昭泰体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44