经修饰的自然杀伤细胞及其用途制造技术

本申请涉及经修饰的自然杀伤细胞及其用途。本申请在某些方面提供了表达白介素‑15(IL‑15)的全部或功能部分的自然杀伤(NK)细胞，以及用于产生这样的细胞的方法。本申请还提供了使用表达白介素‑15(IL‑15)的全部或功能部分的自然杀伤(NK)细胞来治疗对象中的癌症或者增强NK细胞的扩增和/或存活的方法。

【技术实现步骤摘要】
经修饰的自然杀伤细胞及其用途本申请是申请号为201580024756.2的中国专利申请的分案申请，原申请是2015年5月14日提交的PCT国际申请PCT/SG2015/050111于2016年11月11日进入中国国家阶段的申请。相关申请本申请要求于2014年5月15日提交的美国临时申请No.61/993,494的权益。上述申请的全部教导通过引用并入本文。
本文所描述的实施方案涉及经修饰的自然杀伤细胞及其用途。
技术介绍
NK细胞在体内存活和增殖需要细胞因子(例如IL-2和IL-15)的刺激。例如，在对免疫缺陷小鼠进行注射后，活化的NK细胞在1周后变得不可检出，但如果还施用人IL-2，其持续长达一个月仍可检出。因此，使用NK细胞输注的临床方案通常依赖于IL-2施用来延长NK细胞在患者中的存活。然而，IL-2可具有相当大的副作用。除了发热和寒战以外，IL-2施用可导致更严重和可能致命的后果，例如毛细血管渗漏综合征(capillaryleaksyndrom)。降低IL-2的剂量应当降低副作用的风险，但是可导致刺激调节性T细胞，所述调节性T细胞可抑制NK细胞功能并且可能使其抗癌作用无效。因此，开发在体外和/或体内促进NK细胞扩增和活性的替代方式将是重要的。
技术实现思路
本技术方案在某些方面提供了表达白介素-15(IL-15)的全部或功能部分的自然杀伤(NK)细胞，以及用于产生这样的细胞的方法。本技术方案还提供了使用表达白介素-15(IL-15)的全部或功能部分的自然杀伤(NK)细胞来治疗对象中的癌症或者增强NK细胞的扩增和/或存活的方法。附图说明本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，官方将提供带有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本。前述内容将由以下本专利技术的一些实例实施方案的更具体的描述而显而易见，如附图所示，在不同视图中相同的附图标记表示相同部件。附图不一定按比例绘制，而着重于示出本专利技术的一些实施方案。图1A-1C：IL-15构建体的设计和表达。1A.本研究中使用的野生型和膜结合IL-15构建体(“wtIL15”和“mbIL15”)的示意图。1B.用mbIL15转导的NK细胞表面之IL-15的表达。扩增的NK细胞用wtIL15、mbIL15或用仅含有GFP的载体(“模拟(Mock)”)转导。流式细胞术点图示出了如通过抗IL15抗体(R&DSystems)和与藻红蛋白(phycoerythrin)缀合的山羊抗小鼠二抗(SouthernBiotechnologyAssociates)检测到的GFP和IL-15的表达。示出了每个象限中的细胞百分比(＞98％CD56+CD3-NK细胞)。1C.用wtIL15转导的NK细胞的IL-15分泌。对来自3个不同供体的NK细胞一式三份地测试。条表示在无IL-2的情况下培养24和48小时后收集的上清液中进行的ELISA测量的平均值±SD。在模拟转导的细胞的上清液中未检测到IL-15。图2A-2C：表达IL-15的NK细胞在体外的存活和扩增。2A.与来自15个供体的模拟转导和mbIL15转导的细胞(左图)以及来自9个供体的mbIL15或wtIL15转导的细胞之无IL-2的7天平行培养后的输入细胞相比的NK细胞回收百分比。水平条表示中值。示出了成对t检验的结果。用IL-2(10和100IU/mL)培养的结果示于补充图S1中。2B.用低剂量IL-2(10IU/mL)的来自6个供体的模拟转导和mbIL15转导的NK细胞的存活和扩增。2C.来自一个供体的不用IL-2或用低剂量IL-2(100IU/mLIL2的结果示于图6中)培养的用mbIL15、wtIL15转导或模拟转导的NK细胞之扩增和长期存活。示出了在指定培养天数的NK细胞回收百分比。图3A-3C：表达mb-IL15的NK细胞在体内的存活和扩增。3A.在输注后7天和11天，注射了有或无IL-2的模拟转导或mbIL15转导的NK细胞的小鼠(总计16只小鼠)的外周血中人CD45+细胞的绝对数目(在第7天无IL-2的P＝0.004，有IL-2的P＝0.021；在第11天P＝0.044和0.026)。3B.流式细胞点图示出了不用IL-2处理(上部)和用IL-2处理(下部)的小鼠外周血中人CD45+、GFP+NK细胞的存在。示出了有或无GFP表达的人CD45+细胞的百分比。3C.在注射后第11天收集的注射了有或无IL-2的模拟转导或mbIL15转导的NK细胞的小鼠多种组织中人CD45+细胞的百分比。总体而言，mbIL15的人CD45+细胞的百分比显著较高(无IL-2的P＜0.001，有IL-2的P＝0.002)。图4A-4C：表达mbIL15的NK细胞的性质。4A.在用mbIL15转导或模拟转导的NK细胞群中培养7天之前和之后的GFP+细胞的相对比例。示出了来自13个供体的NK细胞的结果；对于mbIL15P＜0.001，对于模拟不显著。4B.mbIL15转导的NK细胞的免疫表型特征。通过流式细胞术对在无IL-2的情况下培养48小时的NK细胞进行细胞标志物分析。所有结果概述于表中。4C.将模拟转导和mbIL15转导的NK细胞在无IL-2的情况下培养48小时，并通过Kinex抗体微阵列(Kinexus)分析细胞裂解物。在测试的809个抗磷蛋白抗体中，示出了信号的Z比值＞0.5且误差范围％＜100的那些。条表示与模拟转导的NK细胞中的归一化强度相比表达mbIL15的NK细胞中的信号变化百分比。图5A-5D：表达mbIL15的NK细胞的抗肿瘤能力。5A.以1∶4和1∶1E∶T比例(在每种比例下进行15次实验；两种比例的P＜0.001)的来自9个供体的mbIL15和模拟转导的NK细胞抗Nalm-6、U937、K562、Daudi、SK-BR-3和ES8细胞系的24小时细胞毒性测定结果。在4小时和24小时细胞毒性测定中用单个细胞系获得的结果示于图7中。5B.表达mbIL15的NK细胞在靶细胞存在下释放裂解性颗粒提高。在以1∶1E∶T的4小时细胞毒性测定后CD107a+NK细胞的百分比。示出了来自3个供体的NK细胞抗2种细胞系的结果(P＝0.007)。5C.表达mbIL15的NK细胞在体内表现出抗肿瘤活性。向NOD-SCID-IL2RGnull小鼠i.p.注射1×104个用萤光素酶标记的U937细胞。在3只小鼠中，未进行处理(“无NK”)，而4只小鼠在第3天和第7天接受模拟转导的NK细胞(1×107i.p.)，并且另外4只小鼠以相同的剂量和方案接受mbIL15转导的NK细胞。示出了肿瘤生长的体内成像结果(腹部图像)。5D.不同处理组中小鼠的总体存活比较。当生物发光达到1×1011个光子/秒时，对小鼠实施安乐死。示出了3条曲线的对数秩检验的P值以及在2条曲线的每一条之间的比较。图6A-6C：表达IL-15的NK细胞在体外的存活和扩增。6A.在不存在IL-2的情况下表达mbIL15的NK细胞的扩增被抗IL-15中和抗体抑制。符号示出在用mbIL1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.免疫细胞，其表达白介素-15(IL-15)的全部或功能部分。/n

【技术特征摘要】
20140515 US 61/993,4941.免疫细胞，其表达白介素-15(IL-15)的全部或功能部分。


2.权利要求1所述的免疫细胞，其中所述IL-15作为膜结合多肽和/或分泌多肽表达。


3.权利要求1所述的免疫细胞，其中分别与不表达mbIL-15或分泌的IL-15的免疫细胞相比，所述免疫细胞在不存在IL-2的情况下表现出增强的存活和扩增。


4.权利要求3所述的免疫细胞，其中所述增强的存活和扩增是体外的，并且其中所述免疫细胞可以在不存在外源IL2的情况下在体外维持2个月。


5.权利要求4所述的免疫细胞，其中所述增强的存活和扩增是体内的。


6.权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述IL-15的全部或功能部分以自分泌方式激活IL-15信号传导和/或抗凋亡信号传导。


7.权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞，其中与不表达所述IL-15的全部或功能部分的免疫细胞相比，所述免疫细胞表现出针对白血病细胞、淋巴瘤细胞和实体瘤细胞增强的细胞毒性。


8.权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞，其中与不表达所述IL-15的全部或功能部分的免疫细胞相比，所述免疫细胞更大程度地浸润一种或更多种组织，其中所述一种或更多种组织选自骨髓、肝、脾、肾和肺。


9.权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞，其中与不表达所述IL-15的全部或功能部分的免疫细胞相比，所述免疫细胞显示出STAT1、STAT3和STAT5、Src、Erk1/2或Mek中一种或更多种的磷酸化增强，并且其中与不表达所述IL-15的全部或功能部分的免疫细胞相比，表达所述IL-15的全部或功能部分的免疫细胞表现出增强的抗凋亡信号传导。


10.权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述IL-15的全部或功能部分包含SEQIDNO：4的氨基酸序列。


11.权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述IL-15的全部或功能部分与跨膜蛋白的全部或一部分融合。


12.权利要求11所述的免疫细胞，其中所述跨膜蛋白选自CD8α、CD4、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD28、CD137、糖蛋白A、糖蛋白D、烟碱型乙酰胆碱受体、GABA受体、FcεRIγ和T细胞受体。


13.权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述mbIL-15包含与CD8α的跨膜结构域的全部或一部分和CD8α的信号肽融合的IL-15的全部或功能部分。


14.权利要求13所述的免疫细胞，其中所述mbIL-15包含SEQIDNO：2的氨基酸序列。


15.权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是CD16阳性的。


16.权利要求1至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述IL-15的全部或功能部分促进以下一种或多种：
i)免疫细胞存活；
ii)对免疫细胞的活化和增殖的调节；以及
iii)支持来自造血干细胞的免疫细胞发育。


17.表达白介素15(IL-15)的全部或...

【专利技术属性】
技术研发人员：达里奥·坎帕纳，大卫·舒克，今村胜，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，圣裘德儿童研究医院，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG