一种细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用制造技术

本发明专利技术属于天然生物纳米材料和肿瘤治疗领域，具体涉及一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用。本发明专利技术将表达人源TRAIL蛋白的病毒转染人或动物细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞，然后大量培养，收集细胞，超声破碎细胞，通过蔗糖密度梯度离心方法对制得的破膜的细胞匀浆液进行超速离心，分层吸出内质网提取物溶液，得到基于细胞内质网来源的生物纳米粒子。本发明专利技术提供的多维多靶点复合纳米粒子，包含上述基于细胞内质网来源的生物纳米粒子和致敏癌细胞凋亡应答活性小分子药物，该复合纳米粒子制备工艺简单，成本低，治疗肿瘤高效安全，药物用量低且无毒副作用。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用
本专利技术属于天然生物纳米材料和肿瘤治疗领域，具体涉及一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumournecrosisfactor(TNF)-relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL))，是一类具有凋亡诱导活性的细胞因子，其与靶细胞表面的死亡受体4或5(DR4/5)结合，募集胞浆内接头蛋白FADD(Fasassociateddeathdomaincontainingprotein)和半胱天冬酶原8(procaspase8)，导致caspase8酶原被激活(CASP-8)；至此，CASP-8可直接激活终末凋亡效应酶CASP-3、CASP-6、CASP-7；CASP-8也可通过切割激活细胞内BID为t-BID，激活CASP-9介导的内源性线粒体凋亡通路，最终激活终末凋亡效应酶CASP-3、CASP-6、CASP-7，引起肿瘤细胞凋亡。TRAIL具有广谱抗癌潜能，它特异性地诱导肿瘤细胞和癌细胞凋亡，而通常情况下对正常细胞无影响，因此受到人们的热切关注。重组可溶型TRAIL(rTRAIL，rT)已被证明可有效诱导癌细胞凋亡，但临床I期试验证实其血液清除率很高，半衰期少于30分钟，其较低的稳定性和生物利用度极大地阻碍了临床应用。近年，有学者用表达TRAIL的慢病毒转染细胞，以细胞或细胞释放的细胞外囊泡(EV)递送膜结合TRAIL治疗癌症，发现其效应显著优于rT。这种膜结合TRAIL改变了TRAIL在血液或细胞外基质中被迅速清除的命运，且TRAIL以聚集体的形式与死亡受体结合，增强凋亡信号的触发，可部分克服抗性癌细胞对TRAIL的耐药性。我们前期研究显示，经转染后的MSC可以高表达TRAIL，并发现大量TRAIL富集在内质网(ER)上。然而，目前尚无关于用内质网来源TRAIL治疗癌症的专利和报道。内质网是蛋白表达的重要合成与加工场所，mRNA在粗面型内质网携带的核糖体上翻译，经由内质网合成多肽，修饰加工，产生具有一定结构和生物活性的蛋白质。许多研究表明，来源于抗原呈递细胞(APC)内质网的微粒体(microsomes)，对病毒感染产生的免疫应答比相应APC的更强烈和持久，这说明内质网及其衍生微粒体上来源的蛋白可以具有显著的生物活性。癌症难以治愈，重要的一个原因在于普遍存在的癌细胞对治疗药物的耐药性。而癌细胞耐药性的产生往往是由于其凋亡通路中关键调控因子的变异、缺失或过度表达。多靶点多维度调控细胞内源性促存活因子或凋亡抑制剂的表达，是致敏癌细胞的TRAIL应答，解决其耐药性的一个重要策略。有研究表明，一种细胞内源性促凋亡因子Smac/Diablo的化学模拟小分子(AZD5582)，可特异性地与凋亡抑制剂(Inhibitorsofapoptosisproteins，IAPs)的BIR结构域结合，屏蔽掉抑制位点或使其泛素化降解，释放caspases，极大地促进凋亡信号的激活、传导及执行。AZD5582(AZD)可与XIAP、cIAP1和cIAP2的BIR3结合，特异性地诱导癌细胞凋亡，但其单独使用的治疗效果有限。
技术实现思路
为了克服现有技术中促凋亡蛋白(比如TRAIL)治疗癌症存在的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种细胞内质网来源的生物纳米粒子(ERN-T)的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的细胞内质网来源的生物纳米粒子，该生物纳米粒子为纳米级别，携带膜结合的促肿瘤凋亡蛋白(TRAIL)。本专利技术的再一目的在于提供上述细胞内质网来源的生物纳米粒子的应用。本专利技术的第四个目的在于提供一种多维多靶点复合纳米粒子，该多维多靶点复合纳米粒子包含上述细胞内质网来源的生物纳米粒子，可共载送促凋亡蛋白和化疗小分子药物(例如：可致敏癌细胞凋亡应答活性小分子)，其中，低剂量的促凋亡蛋白和化疗小分子药物具有协同治疗癌症的作用，可显著增强抗癌效果，并且对正常组织细胞无明显毒性。本专利技术的第五个目的在于提供上述多维多靶点复合纳米粒子的制备方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子的制备方法，包含如下步骤：(1)传代培养：将人或动物细胞进行传代培养，获得第二代(P2)至第四代(P4)的人或动物细胞；(2)将表达人源TRAIL蛋白的病毒转染人或动物细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞；(3)步骤(2)制得的表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞大量培养，收集细胞，然后超声破碎细胞，得到破膜的细胞匀浆液；(4)通过蔗糖密度梯度离心方法对步骤(3)制得的破膜的细胞匀浆液进行超速离心，分层吸出内质网提取物溶液，得到基于细胞内质网来源的生物纳米粒子；步骤(1)中所述的的人或动物细胞包括但不限于：脐带间充质干细胞(UC-MSC)、骨髓间充质干细胞(BM-MSC)、脂肪间充质干细胞(AD-MSC)、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞(293T)、巨噬细胞、T细胞和肿瘤相关成纤维细胞中的至少一种；在具体实施例中，步骤(1)中所述的的人或动物细胞为脐带间充质干细胞(UC-MSC)；步骤(2)中所述的病毒不限于慢病毒、逆转录病毒以及腺病毒；在具体实施例中，步骤(2)中所述的病毒为慢病毒；在具体实施例中，步骤(2)中所述的转染的具体操作为：将状态良好的P2～P4代脐带间充质干细胞，以1×106个/孔接种于六孔板，37℃，5％CO2细胞培养箱过夜；离心去除培养基，然后加入含有表达人源TRAIL蛋白的慢病毒和polybrene的DMEM/F-12培养基，孵育6～24h；孵育后离心去除培养基，加入含有10％FBS(胎牛血清)的DMEM/F12新鲜培养基继续培养2～3天；待细胞长满后，进行增殖传代培养，得到表达TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞；所述的表达人TRAIL蛋白的慢病毒的MOI优选为2，用量选为10～30μL/mL(培养基)；所述的表达人TRAIL蛋白的慢病毒的用量优选为30μL/mL(培养基)；所述的polybrene在DMEM/F-12培养基中的浓度选为5～20μg/mL；所述的polybrene在DMEM/F-12培养基中的浓度优选为8μg/mL；所述的孵育的时间进一步优选为10h；步骤(3)中所述的超声的条件优选为20KHZ超声2min；步骤(4)中所述的蔗糖密度梯度离心方法的具体操作优选为：将破膜的细胞匀浆液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在4℃条件下，以100000g超高速离心3h；然后将液柱中的液体由上至下等体积取出，收集第6～8次取出的液体，即为含有表达TRAIL的细胞内质网来源的生物纳米粒子(ERN-T)溶液；所述的蔗糖密度梯度的液柱通过如下方法建立：从下到上依次缓慢加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子的制备方法，其特征在于包含如下步骤：/n(1)传代培养：将人或动物细胞进行传代培养，获得第二代至第四代的人或动物细胞；/n(2)将表达人源TRAIL蛋白的病毒转染人或动物细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞；/n(3)步骤(2)制得的表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞大量培养，收集细胞，然后超声破碎细胞，得到破膜的细胞匀浆液；/n(4)通过蔗糖密度梯度离心方法对步骤(3)制得的破膜的细胞匀浆液进行超速离心，分层吸出内质网提取物溶液，得到基于细胞内质网来源的生物纳米粒子。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)传代培养：将人或动物细胞进行传代培养，获得第二代至第四代的人或动物细胞；
(2)将表达人源TRAIL蛋白的病毒转染人或动物细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞；
(3)步骤(2)制得的表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞大量培养，收集细胞，然后超声破碎细胞，得到破膜的细胞匀浆液；
(4)通过蔗糖密度梯度离心方法对步骤(3)制得的破膜的细胞匀浆液进行超速离心，分层吸出内质网提取物溶液，得到基于细胞内质网来源的生物纳米粒子。


2.根据权利要求1所述的基于细胞内质网来源的生物纳米粒子的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的的人或动物细胞包括但不限于：脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞、巨噬细胞、T细胞和肿瘤相关成纤维细胞中的至少一种。


3.根据权利要求1所述的基于细胞内质网来源的生物纳米粒子的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的病毒不限于慢病毒、逆转录病毒以及腺病毒。


4.根据权利要求1所述的基于细胞内质网来源的生物纳米粒子的制备方法，其特征在于：
在具体实施例中，步骤(2)中所述的转染的具体操作为：
将状态良好的P2～P4代脐带间充质干细胞，以1×106个/孔接种于六孔板，37℃，5％CO2细胞培养箱过夜；离心去除培养基，然后加入含有表达人源TRAIL蛋白的慢病毒和polybrene的DMEM/F-12培养基，孵育6～24h；孵育后离心去除培养基，加入含有10％FBS的DMEM/F12新鲜培养基继续培养2～3天；待细胞长满后，进行增殖传代培养，得到表达TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁正强，候欢，柯长洪，苏奎，黄超鸿，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44