一种基因高表达在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增殖方面的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种基因高表达在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增殖方面的用途。本发明专利技术发现，提高基因miR‑876‑5p的表达水平可以促进人脐带间充质干细胞体外增殖，因而可以通过在细胞培养基中添加提高基因miR‑876‑5p表达水平的物质在体外提高种子细胞hUC‑MSCs的获得效率和数量。

【技术实现步骤摘要】
一种基因高表达在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增殖方面的用途
本专利技术属于干细胞领域，涉及干细胞的培养，具体涉及一种基因高表达在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增殖方面的用途。
技术介绍
间充质干细胞(MSCs)是一类来源于发育早期中胚层、具有多向分化及自我更新潜能的成体干细胞。MSCs的来源主要包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊膜等。其中，人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)因取材方便、来源广泛、免疫原性低且不受伦理学争议等众多优势，成为最具潜力的种子细胞。种子细胞应用第一重要的就是数量，因此，提高种子细胞体外增殖速度一直是研究热点。
技术实现思路
本专利技术是为了提供一种基因高表达在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增殖方面的用途，以在体外提高种子细胞hUC-MSCs的数量。技术方案：一种通过提高基因表达水平的方法在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增值方面的用途，所述基因为miR-876-5p。一种用于人脐带间充质干细胞体外培养促进其增值的培养基，在培养基中添加提高基因miR-876-5p表达水平的物质。技术效果：本专利技术发现，提高基因miR-876-5p的表达水平可以促进人脐带间充质干细胞体外增殖，因而可以通过在细胞培养基中添加提高基因miR-876-5p表达水平的物质在体外提高种子细胞hUC-MSCs的获得效率和数量。附图说明图1为人脐带间充质干细胞倒置显微镜观察结果；可见细胞呈梭形，呈漩涡状生长，符合人脐带间充质干细胞的生长特点。图2为各组人脐带间充质干细胞中miR-876-5p相对表达水平；与空白对照组相比，过表达组人脐带间充质干细胞中miR-876-5p表达水平显著升高(P＜0.05)，说明miR-876-5p过表达慢病毒已经成功将miR-876-5p转染进入人脐带间充质干细胞中。与空白对照组相比，阴性对照组miR-876-5p表达水平无显著差异(P＞0.05)。图3为各组人脐带间充质干细胞培养48h细胞数量(×105个/孔)；过表达组人脐带间充质干细胞数量显著高于空白对照组(P＜0.05)，阴性对照组人脐带间充质干细胞数量与空白对照组无显著差异(P＞0.05)。具体实施方式一、实验材料人脐带间充质干细胞购自上海传秋生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM/F12(1:1)培养基购自购自美国Gibco公司。miR-876-5p过表达慢病毒及其阴性对照慢病毒、RT-PCR引物序列由吉凯基因构建。二、实验方法1、人脐带间充质干细胞的培养、传代、形态观察和表型检测将冻存的人脐带间充质干细胞按常规方法复苏后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养于T25培养瓶中，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。2～3d换一次液，待细胞长满瓶底面积80％～90％时传代。传代比例为1:5，步骤为：将0.25％胰酶-0.53mMEDTA消化液与DPBS置于37℃预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5mLDPBS，轻晃洗涤后弃去。使用DPBS将胰酶稀释4倍，往瓶中加2mL稀释后的胰酶，置于室温孵育消化，消化好后加入2mL含血清的完全培养基终止消化。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液并吹打成单个细胞悬液，1200rpm离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，进行传代。取传代后生长状态良好的人脐带间充质干细胞用于后续实验。形态观察：在倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞的形态和生长情况，拍照。表型检测：将人脐带间充质干细胞用0.25％胰酶消化，PBS重悬，制备1×106/mL的细胞悬液。然后取100μL细胞悬液与20μL标记一抗(CD73-PE、CD90-FITC、CD105-APC、CD34-PE、CD45-APC、HLA-DR-FITC)4℃避光孵育1h，上流式细胞仪检测细胞表型分子阳性率。2、细胞转染、培养和计数取生长状态良好的hUC-MSCs，以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞生长至70％～80％融合度时，按照病毒感染比率值(MOI)50:1分别加入miR-876-5p过表达慢病毒及其阴性对照慢病毒感染人脐带间充质干细胞，同时设置不做任何处理的人脐带间充质干细胞作为空白对照，记为过表达组、阴性对照组和空白对照组，每组2个复孔，5块6孔板平行操作。培养6h后，洗涤、收集其中2块6孔板上的各组细胞用于miR-876-5p相对表达水平检测，其余3块6孔板用PBS洗涤细胞并更换新鲜的完全培养液，继续培养48h后采用细胞计数板法分别对各组每孔细胞数量进行计数，每组6个孔。3、人脐带间充质干细胞转染后表型检测和miR-876-5p相对表达水平检测转染培养6h后，miR-876-5p相对表达水平检测的方法为：根据试剂盒说明书用Trizol试剂提取细胞总RNA，用1μg总RNA和PrimeScriptTMRT试剂盒通过反转录反应合成cDNA，用SYBRPremixExTaq在RT-PCR仪上进行RT-PCR，以GAPDH为内参，通过2-ΔΔCt法分析各组人脐带间充质干细胞中miR-876-5p的相对表达水平，并以空白对照组计为1.00。RT-PCR引物序列如下：miR-876-5p正向序列：5'-GGAGTGGTACAGTGCTCAGT-3'miR-876-5p反向序列：5'-GAGCGAGATGAACTGCTGTG-3'GAPDH正向序列：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'GAPDH反向序列：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'将上述“2、细胞转染、培养和计数”步骤中，继续培养48h并计数后的细胞收集，PBS洗涤，取少量细胞按照“1、人脐带间充质干细胞的培养、传代、形态观察和表型检测”中的表型检测方法检测表型。4、统计学处理数据采用GraphPadPrism5.0软件进行统计处理，以x±s表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05表示具有显著性差异。三、实验结果1、人脐带间充质干细胞形态观察和表型检测结果倒置显微镜观察结果如图1所示，细胞呈梭形，呈漩涡状生长，符合人脐带间充质干细胞的生长特点。表型检测结果如表1所示，CD34、CD45、HLA-DR表达水平很低，CD73、CD90、CD105表达水平很高，符合人脐带间充质干细胞的表型特点。表1细胞表型分子阳性率细胞表型分子阳性率阳性率(％)CD7398.5CD9098.8CD10598.2CD342.73CD451.69HLA-DR0.872、转染、计数和表型检测检测结果<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过提高基因表达水平的方法在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增值方面的用途，所述基因为miR-876-5p。/n

【技术特征摘要】
1.一种通过提高基因表达水平的方法在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增值方面的用途，所述基因为miR-876-5p。

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【专利技术属性】
技术研发人员：张川，
申请(专利权)人：张川，
类型：发明
国别省市：江苏;32