一种CHO-DHFR+细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种CHO‑DHFR+细胞株及其应用。该细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2019264。本发明专利技术的CHO‑DHFR+细胞株能够无血清悬浮高密度培养，培养过程中仅需在培养体系中添加少量谷氨酰胺，即可维持细胞正常生长和生产，降低了谷氨酰胺代谢产生的有毒废物NH

【技术实现步骤摘要】
一种CHO-DHFR+细胞株及其应用
本专利技术属于生物制药
，涉及一种CHO-DHFR+细胞株及其应用。
技术介绍
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞，因为与其他系统相比，CHO细胞具有以下优点：①CHO细胞对蛋白有准确的加工、修饰功能，因此其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白；②CHO细胞耐受剪切力和渗透压的能力相对较强，可根据培养要求选择可贴壁培养或悬浮培养的方式；③整合外源基因后的细胞稳定，重组基因能高效扩增和表达；④表达的目的蛋白可由细胞内运输到细胞外，并且CHO细胞只表达少量的内源蛋白，有利于目的蛋白的提取。如今，市场上一半以上最为畅销的生物制剂是由CHO细胞产生的。如，阿达木单抗(Humira)、贝伐单抗(Avastin)和利妥昔单抗(Rituxan)。可以说，CHO细胞对现代生物药工业发展做出了不可磨灭的贡献。目前CHO细胞在工业上的筛选类型有：①二氢叶酸还原酶营养缺陷突变细胞株(代表细胞CHO-DG44(Thermo),CHO-DUXB11(ChasinLab))：DHFR是dihydrofolatereductase的缩写。该细胞系为DHFR基因缺陷型。DHFR用于催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。突变体不能合成四氢叶酸。因而不能在缺乏次黄嘌呤(Hypoxanthine)和胸腺嘧啶(thymidine)的培养基上生长。只有导入DHFR或者培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶才能生长。因此DHFR可作为筛选标记或报告基因。CHO-DG44在1983年诞生。CHO-DG44具有DHFR双缺陷，被敲除了2个位点。DG44可用于筛选，在工业使用也最广泛。氨甲喋呤(MTX)是DHFR的拮抗剂，可使DHFR大量表达，因此可使细胞外源基因的拷贝数扩增并得到较高表达。DHFR基因扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。但该系统也存在一些不足，如该方法需要较高浓度的MTX，而外源基因表达水平不高，增加了筛选细胞克隆的工作量等。②谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统(代表细胞CHOK1SV-KO(Lonza)，CHOZN(Merk)，CHO-S(Thermo))是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率，速度快，稳定性好，产量高等优势，同时该系统由于不需要额外谷氨酰胺的添加导致了更低的代谢废物氨的含量，更好的细胞活率，更有利于后续的工业化生产，但使用成本较高。CN107760650A公开了一种经改造的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及其用途，所述经改造的CHO细胞能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度生长，并且优选地不表达功能性的谷氨酰胺合成酶和岩藻糖基转移酶8。该方法敲除了CHO细胞的内源性GS基因，因此，后续培养过程中需要在培养基中补加较大量的谷氨酰胺，而谷氨酰胺不稳定，4℃下放置7天即可分解约50％，而且降解产物不利于细胞生长。
技术实现思路
基于现有技术存在的问题，本专利技术的第一目的在于提供一种高效表达重组蛋白的CHO-DHFR+细胞株，该CHO-DHFR+细胞株经过筛选获得并进行了生物材料保藏，保藏日期：2019.11.09；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址：中国武汉武汉大学，邮编430072；保藏编号：CCTCCNO：C2019264；分类命名：中国仓鼠卵巢细胞CHO-DHFR+。本专利技术的第二目的在于提供该保藏的CHO-DHFR+细胞株在表达重组蛋白中的应用。本专利技术的第三目的在于提供一种表达重组IL-10的工程细胞株的构建方法。本专利技术的第四目的在于提供上述构建方法构建获得的表达重组IL-10的工程细胞株。本专利技术的第五目的在于提供一种利用上述表达重组IL-10的工程细胞株培养表达重组IL-10的方法。本专利技术的目的通过以下技术手段得以实现：一方面，本专利技术提供一种CHO-DHFR+细胞株，该细胞株的保藏编号为CCTCCNO：C2019264。本专利技术的CHO-DHFR+细胞株是通过脂质体将pSV2-DHFR质粒转染后利用无HT的CDOptiCHO培养基加压筛选获得，其与谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统细胞株具有类似的性能，该CHO-DHFR+细胞株能够无血清悬浮高密度培养，培养过程中仅需在培养体系中添加少量谷氨酰胺，即可维持细胞正常生长和生产，降低了谷氨酰胺代谢产生的有毒废物NH4+的积累，同时能够高效表达重组蛋白(例如：重组IL-10)。另一方面，本专利技术还提供上述筛选保藏的CHO-DHFR+细胞株在表达重组蛋白中的应用。上述的应用中，优选地，所述重组蛋白包括重组IL-10。再一方面，本专利技术还提供一种表达重组IL-10的工程细胞株的构建方法，其包括以下步骤：将优化后的IL-10基因连接至pcDNA3.1-β质粒上，构建获得重组质粒载体；采用脂质体2000将重组质粒载体转染进入上述筛选保藏的CHO-DHFR+细胞株中，得到表达重组IL-10的工程细胞株。上述的构建方法中，优选地，所述优化后的IL-10基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。SEQIDNO：1：ATGCACTCCAGCGCCCTGCTGTGCTGTCTGGTGCTGCTGACCGGCGTGAGAGCTTCTCCTGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACTCCTGCACACATTTCCCCGGCAACCTGCCTAATATGCTGAGGGACCTGCGGGATGCCTTTTCCCGCGTGAAGACATTCTTTCAGATGAAGGACCAGCTGGATAATCTGCTGCTGAAGGAGAGCCTGCTGGAGGACTTCAAGGGCTACCTGGGCTGTCAGGCTCTGTCTGAGATGATCCAGTTTTATCTGGAGGAAGTGATGCCACAGGCCGAGAACCAGGACCCCGATATCAAGGCTCACGTGAACTCCCTGGGCGAGAATCTGAAGACCCTGAGACTGCGCCTGAGGCGGTGCCATAGGTTCCTGCCATGTGAGAATAAGTCCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAACGCTTTTAATAAGCTGCAGGAGAAGGGCATCTACAAGGCCATGAGCGAGTTCGATATCTTTATCAACTACATCGAGGCTTATATGACAATGAAGATCAGGAATTGA所述优化后的IL-10基因的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。SEQIDNO：2：MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN将优化后的IL-10基因(SEQIDNO：1)连接至pcDNA3.1-β质粒上，构建获得重组质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CHO-DHFR+细胞株，该细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2019264。/n

【技术特征摘要】
1.一种CHO-DHFR+细胞株，该细胞株的保藏编号为CCTCCNO：C2019264。


2.权利要求1所述CHO-DHFR+细胞株在表达重组蛋白中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述重组蛋白包括重组IL-10。


4.一种表达重组IL-10的工程细胞株的构建方法，其包括以下步骤：
将优化后的IL-10基因连接至pcDNA3.1-β质粒上，构建获得重组质粒载体；
采用脂质体2000将重组质粒载体转染进入权利要求1所述CHO-DHFR+细胞株中，得到表达重组IL-10的工程细胞株。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其中，所述优化后的IL-10基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔磊，杨盼盼，郑彬彬，王建刚，吴明远，
申请(专利权)人：康立泰药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37