使用永生化单核细胞和诱导细胞的抗感染药物、疫苗等的评价方法技术

本发明专利技术是鉴于在单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物研究中的稳定性、再现性、经济性以及易操作性有关的问题而作出的，其目的在于提供利用具有增殖能力的单核细胞维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法。本发明专利技术基于登革热病毒能够在将基因导入CD14阳性细胞获得的能够增殖的人单核细胞和通过分化诱导该单核细胞获得具有吞噬能力的细胞(例如树突状细胞)中高效率地感染和增殖的发现。由此，对于用于治疗单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物传染病的化合物和疫苗等药物，提供了一种用于评价的新方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用永生化单核细胞和诱导细胞的抗感染药物、疫苗等的评价方法
本专利技术涉及单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的体外(invitro)培养方法或该微生物传染病治疗药物的评价方法等。
技术介绍
在传染病研究中，目标病原菌通过单核细胞或树突状细胞(Dendriticcells)增殖时，使用已经构建的细胞系进行研究。例如，登革热病毒是被进行了长年研究的引起人感染的病毒，根据经验使用人类慢性髓性白血病来源的K562细胞系、非洲猕猴的肾脏上皮细胞来源的Vero细胞系、叙利亚仓鼠肾脏来源的BHK细胞系等细胞系进行研究。但是，使用这些细胞系的评价虽然具有容易进行的优点，但是存在不一定能反映人体内的感染和增殖的问题。使用人体来源的单核细胞和树突状细胞，能够进行更近于生物体的机制和抗原的分析，因此期待据此开发新的药物、疫苗。理论上使用人体来源的白细胞样细胞可以进行感染评价，也能使用从个体切除的组织分离出的细胞进行感染评价。例如，据报告，脐带血、骨髓、末梢血来源的造血干细胞可以在体外(invitro)分化为血细胞，甚至分化为单核细胞和诱导细胞。另外，也有报告称，通过由胚胎干细胞(ES细胞)、诱导性多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞进行分化诱导来制备单核细胞和进一步分化的树突状细胞等的方法(专利文献1、非专利文献1～9)。但是，单核细胞和树突状细胞难于在体外持续地增殖，因此使用切除来源的细胞进行细胞制备时需要从个体内提取和分离，存在操作繁琐费用高昂的问题。另外，这些方法存在在分化诱导中耗时、单核细胞和分化的树突状细胞的供给量少、难于持续地连续提供研究所需的量的问题。另外，细胞来源的个体和制备细胞的条件可能每次都不同，因此，存在再现性的评价困难的问题。如此，充分反映人体内的感染和增殖状态的同时具有良好再现性且能够评估单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的细胞在此之前是不存在的。由于这类实验上的限制，虽然弄清楚了单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物为单核细胞和树突状细胞介导的，但是还没有弄清楚关于合适病毒增殖的条件等的全部内容。为此，使用从个体切除的细胞的实验中，也存在成为研究对象的单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物研究不一定是在合适条件下进行的问题。另一方面，由于在癌症等的免疫疗法中进行细胞治疗时需要制备大量的抗原提呈细胞，因此进行了关于能够增殖的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞的研究。有报告称，向从iPS细胞分化诱导的髓系细胞(iPS-MC)和末梢血来源的单核细胞进行基因导入，从而制造具有自我增殖能力的髓系细胞系(iPS-ML)和单核细胞系(CD14-ML)(专利文献2和专利文献3)。并且公开了，作为登革热病毒感染模型，单核细胞来源的树突状细胞由于其品质、增殖、供体依赖性的特性而受到限制，对上述的iPS-ML来源的树突状细胞(iPS-ML-DC)感染登革热病毒，使HLA(人类白细胞抗原)匹配的T细胞活化(非专利文献10)。但是，使用iPS细胞时，存在由于iPS细胞的残留而癌化和从iPS稳定且高度可靠地分化诱导髓系细胞存在困难、需要从诱导后的细胞群中可靠地仅分离出髓系细胞等很多问题。另外，已知的，CD4+单核细胞作为抗原提呈细胞的能力出色(非专利文献11)，而iPS来源的髓细胞(iPS-ML)的CD4表达低(非专利文献12)。另外，从感染患者的病毒分离是为确认感染和检查、研究的重要的操作。病毒分离是通过采集感染患者的血液等，通过使用培养细胞进行操作来实施的。例如，为登革热病毒时，一般使用发病后5～6天以内的血清样品和为白纹伊蚊培养细胞系的C6/36细胞等进行(非专利文献13)。但是，血清样品中的病毒浓度和从样品采集到开始培养的时间等影响病毒分离的效率，存在病毒分离不一定能成功的问题。例如，已知的，当为登革热病毒时，血清样品中病毒的浓度因为患者的恢复而减少，以及采血后存活病毒数量不断减少。因此，已知的，病毒分离的成功率为60％左右，在被认为病毒量减少的发病后第5天以后，该比例会更低(非专利文献14)。另外，疫苗的开发中需要能够培养使病毒变异的培养细胞。特别是弱毒疫苗的开发，其使用异源培养的细胞等多次重复传代而得到弱毒化的病毒变异体作为疫苗进行利用。但是病毒的变异发生频率很低，需要长时间的研究时间，即需要培养时间。例如，有报告称，为弱毒性疫苗的轮状病毒疫苗(RV1)时，将人病毒使用非洲绿猴肾细胞传代33次后，将3次有限稀释后筛选的株进一步使用Vero细胞传代7次才能获得(非专利文献15)。如此，已知通常未经过多次培养的话是无法获取弱毒化变异株的。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2008/056734专利文献2：WO2012/043651专利文献3：日本特开2017-131136非专利文献非专利文献1：FairchildP.J等,CurrBiol.(2000)10:1515-1518.非专利文献2：LindmarkH等,ExpCellRes(2004)300：335-344.非专利文献3：ZhanX等,Lancet(2004)364:163-171.非专利文献4：SluKvinII等,JImmunol(2006)176:2924-2932.非专利文献5：OdegaardJI等,JLeukocBiol(2007)81：711-719.非专利文献6：SuZ等,ClinCancerRes(2008)14:6207-6217.非专利文献7：TsengSY等,RegenMed(2009)4:513-526.非专利文献8：SenjuS等,Stemcells(2007)25:2720-2729.非专利文献9：ChoiKD等,JClinInvest(2009)119:2818-2829.非专利文献10：DaoHuyManhra等,JGenVirol.(2018)doi:10.1099/jgv.0.001119.非专利文献11：G.Szabo等,J.Leukoc.Biol.(1990)；47(2):111-20.非专利文献12：ChihiroKoba等,PLoSOne.2013；8(6):e67567.非专利文献13：亀岡，モダンメディア(Modernmedia)61卷9号2015《臨床検査アップデート(译文：临床检查前沿)》265.非专利文献14：RichiardG.Jarman等,AmJTropMedHyg.2011；84(2):218-223.非专利文献15：ロタウイルスワクチンに関するファクトシート(译文：关于轮状病毒的情况说明书)(平成24年9月28日)国立感染症研究所
技术实现思路
即，本专利技术的课题在于在单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物研究中，发现具有更好的稳定性、再现性、经济性以及易操作性的方法。另外，本专利技术的目的在于提供一种通过短时间培养能够取得单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的变异体的方法。...

【技术保护点】
1.一种维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法，其包括：/n使所述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从所述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；以及，/n培养感染的细胞的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180827 JP 2018-1585121.一种维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法，其包括：
使所述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从所述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；以及，
培养感染的细胞的步骤。


2.一种维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法，其包括：
将选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因导入单核细胞的步骤；
从任意所述单核细胞分化诱导树突状细胞的步骤；
使所述感染性微生物感染所得到的单核细胞或树突状细胞的步骤；以及，
培养感染的细胞的步骤。


3.一种鉴定单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的传染病治疗药物的方法，其包括：
在被测药物存在的情况下，使所述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从所述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；以及，
测定所述单核细胞或树突状细胞中的所述感染性微生物的感染水平的步骤；
根据测定得到的所述感染性微生物的感染情况，判定该被测药物是否具有所述传染病治疗效果的步骤；
其中，测定得到的所述感染性微生物的感染水平与所述被测药物不存在的情况下使所述感染性微生物感染所述细胞的对照的感染水平比较，前者少时，判定该被测药物具有所述传染病治疗效果。


4.一种制作单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的变异株的方法，其包括：
使所述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从所述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；以及，
培养感染的单核细胞或所述树突状细胞来增殖所述感染性微生物的步骤；
从增殖的所述感染性微生物中分离变异株的步骤。


5.一种制造...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫﨑和雄，山中敦史，冈田稔，千住觉，
申请(专利权)人：迈凯恩技术有限公司，国立大学法人熊本大学，国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP