慢病毒包装载体与包装方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种慢病毒包装载体与包装方法。该慢病毒包装载体，沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的第一LTR和位于下游的第二LTR，所述第一LTR和所述第二LTR之间具有反向插入的基因表达盒；所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子、目的基因和多腺苷酸化信号；当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子阻遏所述目的基因的表达。

【技术实现步骤摘要】
慢病毒包装载体与包装方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种慢病毒包装载体与包装方法。
技术介绍
慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。目前慢病毒载体的研究都集中在感染能力、特异性、包装容量等方面，而对于包装的目的基因(geneofinterest，GOI)对于病毒的影响关注很少，在实践中，有相当一部分目的基因由于自身表达会干扰慢病毒的包装过程，是无法获得有效的慢病毒颗粒。另一方面，在慢病毒载体中，因为病毒包装过程中会经过转录的过程，而circRNA等包含重要剪接位点的外源基因在包装过程中会有大比例的剪接发生，从而使最终的病毒颗粒中的外源基因序列发生缺失。目前也没有针对这种情况的有效解决方法。
技术实现思路
本专利技术涉及一种慢病毒包装载体，沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的第一LTR和位于下游的第二LTR，所述第一LTR和所述第二LTR之间具有反向插入的基因表达盒；所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子、目的基因和多腺苷酸化信号；当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子阻遏所述目的基因的表达；所述目的基因为需要精确终止表达的基因。根据本专利技术的再一方面，本专利技术还涉及一种慢病毒包装载体系统，其能产生只有一次感染能力而无复制能力的HIV载体颗粒，并包含如上所述的慢病毒包装载体。根据本专利技术的再一方面，本专利技术还涉及一种慢病毒的包装方法，所述方法将包含如上所述的慢病毒包装载体系统转入宿主细胞，并于所述阻遏物存在的前提下进行包装。在慢病毒载体中是不能够出现正向PolyA信号，PolyA信号会使得病毒RNA的转录提前终止，进而严重的影响病毒的滴度。因此，慢病毒载体不适合用于表达需要精确终止表达的基因，例如PolII启动子启动的长链非编码RNA，会因为不能及时终止而使LncRNA带上大段的载体序列(例如WPRE)，从而影响LncRNA的生物学功能，再比如circRNA等包含重要剪接位点的外源基因构建到慢病毒载体中，会在病毒RNA生成过程中发生剪接而丢失外源基因申请人发现，反向表达框可以避免PolyA信号导致的病毒RNA的转录提前终止，可以使LncRNA有效终止，同时对于circRNA反向表达框也可以使其剪接位点不再发挥作用从而保证基因完整性，但由于反向表达框与病毒RNA的转录冲突的缘故（可能是由于反向表达框的启动子的转录过程与病毒RNA的转录冲突，或者是反向转录出来的RNA和正向转录出来的会形成双链RNA，从而影响病毒包装），因而也无法有效的实现需要精确终止表达的基因在慢病毒中的包装。本专利技术创造性的将阻遏型操作子调控系统应用于反向PolyA慢病毒载体，可以实现反向表达框慢病毒病毒高效的包装。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1~图5依次为本专利技术一个实施例中pcDNA3.1-CymR、CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO载体的质粒图谱；图6为本专利技术一个实施例中CymR-CuO在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果；图7为本专利技术一个实施例中CMV-TrpO质粒图谱；图8为本专利技术一个实施例中色氨酸操作子系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果；图9为本专利技术一个实施例中EF1a-ToxO质粒图谱；图10为本专利技术一个实施例中白喉毒素抑制子调控系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果；图11为本专利技术一个实施例中SFH-LacO质粒图谱；图12为本专利技术一个实施例中乳糖操作子系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果；图13为本专利技术一个实施例中TrpO元件相对于CMV的TATABox的插入位置示意图；图14为本专利技术一个实施例中TrpO元件不同插入位置对阻遏效率的影响；图15为本专利技术一个实施例中CuO元件相对于CMV的TATABox的插入位置示意图；图16为本专利技术一个实施例中CuO元件不同插入位置对阻遏效率的影响；图17~图19依次为本专利技术一个实施例中pSLenti-TKPolyA-mCherry-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE、pSLenti-TKPolyA-mCherry-CuO-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE、pSLenti-TKPolyA-mCherry-TrpO-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE载体的质粒图谱；图20为本专利技术一个实施例中阻遏型操作子提高反向表达框的慢病毒载体的表达效率结果的荧光图；图21为本专利技术一个实施例中阻遏型操作子提高反向表达框的慢病毒载体的滴度结果的统计图；图22为本专利技术一个实施例中反向表达框的慢病毒载体不同PolyA信号序列对滴度影响结果的荧光图；图23为本专利技术一个实施例中反向表达框的慢病毒载体不同PolyA信号序列对滴度影响结果的统计图；图24为本专利技术一个实施例中pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS载体图谱；图25为本专利技术一个实施例中pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-hsa_circ_0008285载体图谱；图26为本专利技术一个实施例中感染和转染293T的荧光图片；图27为本专利技术一个实施例中hsa_circ_0008285表达情况的统计图；图28为本专利技术一个实施例中反向表达框的慢病毒载体表达hsa_circ_0008285基因的结果图；图29为本专利技术原理示意图。具体实施方式现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，旨在本专利技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本专利技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.慢病毒包装载体，其特征在于，沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的第一LTR和位于下游的第二LTR，所述第一LTR和所述第二LTR之间具有反向插入的基因表达盒；/n所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子、目的基因和多腺苷酸化信号；/n当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子阻遏所述目的基因的表达；/n所述目的基因为需要精确终止表达的基因。/n

【技术特征摘要】
1.慢病毒包装载体，其特征在于，沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的第一LTR和位于下游的第二LTR，所述第一LTR和所述第二LTR之间具有反向插入的基因表达盒；
所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子、目的基因和多腺苷酸化信号；
当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子阻遏所述目的基因的表达；
所述目的基因为需要精确终止表达的基因。


2.根据权利要求1所述的慢病毒包装载体，其特征在于，所述目的基因用于表达PolII启动子表达的非编码RNA。


3.根据权利要求2所述的慢病毒包装载体，其特征在于，所述非编码RNA选自snRNA、lncRNA、amiRNA或circ-RNA。


4.根据权利要求1所述的慢病毒包装载体，其特征在于，所述多腺苷酸化信号为TKPolyA和/或SV40PolyAV2。


5.根据权利要求1~4任一项所述的慢病毒包装载体，其特征在于，所述阻遏型操作子选自色氨酸操作子和/或Cumate-CuO可调控系统。


6.根据权利要求5所述的慢病毒包装载体，其特征在于，所述氨酸操作子中的TrpO元件在所述基因表达盒的插入位置距离所述启动子的TATABOX小...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨兴林，杨佳丽，杨蕊菊，潘讴东，贾国栋，夏清梅，
申请(专利权)人：和元生物技术上海股份有限公司，和元智造上海基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31