一种质粒组合及其在制备经修饰的免疫细胞中的应用制造技术

本申请提供采用四质粒系统制备修饰的免疫效应细胞的方法。所述方法包括在293T细胞内四个质粒形成慢病毒，提取获得慢病毒，再用慢病毒转染免疫效应细胞，表达嵌合抗原受体。本申请还提供使用所述方法获得的免疫效应细胞、包含所述免疫效应细胞的组合物的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种质粒组合及其在制备经修饰的免疫细胞中的应用
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种采用四质粒系统转染293T细胞的方法，所述方法在293T细胞内四个质粒形成慢病毒，提取获得慢病毒，再用慢病毒转染T细胞，使其表达靶向CD19的嵌合抗原受体。本申请还涉及使用所述方法获得的免疫效应细胞、包含所述免疫效应细胞的组合物及其用途。
技术介绍
急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)以及B细胞淋巴瘤的临床治疗，目前以化疗、干细胞移植及生物治疗等为主，虽然可以取得一定的疗效，但复发难治仍然是难以攻克的重点，肿瘤的细胞免疫治疗作为一种新的治疗策略，成为当今研究的热点。CD19几乎表达于所有的B细胞肿瘤细胞表面，而其他实质细胞和造血干细胞几乎不表达。肿瘤细胞通过下调参与T细胞识别及抗原反应的分子表达、降低免疫原性等途径产生免疫逃逸，从而使机体的免疫系统不能很好的清除肿瘤。研究发现，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）能够识别肿瘤细胞表面的抗原，特异性杀伤肿瘤细胞，用于肿瘤的治疗。当前现有技术中采用的质粒包装系统制备的慢病毒中有活性的病毒比例低，转染滴度低，要达到理想的T细胞转染效果，需要加入更高剂量的慢病毒，因此成本高，残留项多，安全性差。虽然现有技术中也有开始使用四质粒包装系统替换三质粒包装系统，但还没有确认的质粒比例，可用于同时提高转染滴度和保障安全性，因此亟待筛选合适的四质粒比例用于慢病毒载体的包装，用于制备经修饰的免疫效应细胞。
技术实现思路
针对现有技术中的问题，本专利技术提供四质粒包装系统，由目标质粒和三种辅助质粒组合配置而成，目标质粒上去除了病毒包装的非必要元件，有效降低了安全隐患。本专利技术通过特定的四质粒比例配比，有效提高了所制备慢病毒的转染滴度。使得装载有特定CAR的慢病毒载体，感染T细胞后获得的CAR-T细胞，具有良好的临床治疗效果，且安全性较高。本申请提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，本申请还提供编码所述嵌合抗原受体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述嵌合抗原受体、所述核酸分子和/或所述载体的免疫效应细胞、制备所述免疫效应细胞的方法、包含所述免疫效应细胞的组合物以及所述嵌合抗原受体的用途。本申请所述的嵌合抗原受体至少包含以下一种有益效果：（1）在免疫细胞（例如，T细胞）表面稳定表达，表达量高；（2）具有较强的杀伤CD19阳性靶细胞的能力；（3）促进免疫细胞分泌细胞因子，例如，使T细胞分泌细胞因子（INF-γ或IL-6）的能力增强至少1倍、2倍或3倍以上；（4）无溶血性，不引起红细胞溶血或凝聚；（5）无血管刺激性，给药后不引起给药局部或全身异常；（6）无致瘤性，体内或体外不致瘤；（7）延长肿瘤患者的生存时间；（8）有效缓解肿瘤（例如，成人急性淋巴细胞白血病、儿童急性淋巴细胞白血病和/或非霍奇金淋巴瘤）病情；和，（9）安全性高，引起副作用（例如，细胞因子释放综合征或CAR-T细胞相关性脑病综合征）的风险较低。一方面，本申请提供一种质粒组合，其中，所述质粒组合包含质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev，并且所述质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev的比例为2-6:1-1.5:1-3:1-1.5。在某些实施方式中，所述质粒组合的所述质粒Seq1包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述质粒组合的所述质粒Seq1包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述核酸分子包含SEQIDNO.2所示的核酸序列。在某些实施方式中，所述质粒组合的所述质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev的比例为11.8：3.53：6.33：2.3、13.8：3.48：5.31：2.54或14：4.67：4.67：4.67。一方面，本申请提供一种制备慢病毒载体的方法，所述方法包括将所述的质粒组合导入细胞。在某些实施方式中，所述导入为转染。一方面，本申请提供一种使用四质粒包装系统转染细胞获得慢病毒载体的方法，其中，所述质粒包装系统包含质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev，并且质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev的比例为2-6:1-1.5:1-3:1-1.5。在某些实施方式中，所述质粒Seq1表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述质粒Seq1包含一种编码嵌合抗原受体的分离的核酸分子，所述核酸分子包含SEQIDNO.2所示的核酸序列。在某些实施方式中，所述质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev的比例为11.8：3.53：6.33：2.3或13.8：3.48：5.31：2.54。在某些实施方式中，所述细胞是293T。在某些实施方式中，所述细胞是293T/17。一方面，本申请提供一种嵌合抗原受体，其包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。另一方面，本申请还提供一种分离的核酸分子，其编码本申请所述的嵌合抗原受体。另一方面，本申请还提供编码嵌合抗原受体的分离的核酸分子，其包含SEQIDNO.2所述的核酸序列。另一方面，本申请还提供一种质粒，其包含本申请所述的核酸分子。另一方面，本申请还提供制备经修饰的免疫效应细胞的方法，所述方法包括根据所述制备慢病毒的方法制备得到所述慢病毒载体。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述慢病毒载体导入免疫效应细胞。在某些实施方式中，所述导入为转染。在某些实施方式中，所述免疫效应细胞选自以下组：T淋巴细胞和自然杀伤细胞。另一方面，本申请还提供一种经修饰的免疫效应细胞，其包含经所述制备经修饰的免疫效应细胞的方法制备得到经修饰的免疫效应细胞。在某些实施方式中，所述免疫效应细胞选自以下组：T淋巴细胞和自然杀伤细胞。在某些实施方式中，所述免疫效应细胞能够表达本申请所述的嵌合抗原受体。另一方面，本申请还提供一种组合物，其包含本申请所述方法获得的经修饰免疫效应细胞。在某些实施方式中，所述免疫效应细胞选自以下组：T淋巴细胞和自然杀伤细胞。在某些实施方式中，所述免疫效应细胞的表面表达本申请所述的嵌合抗原受体。另一方面，本申请还提供所述方法制备的免疫效应细胞和/或包含所述免疫效应细胞的组合物的嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的载体和/或所述的免疫效应细胞用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗与CD19的表达相关的疾病或病症。在某些实施方式中，所述与CD19的表达相关的疾病或病症包括非实体瘤。在某些实施方式中，所述非实体瘤包括白血病和/或淋巴瘤。在某些实施方式中，所述与CD19的表达相关的疾病或病症包括急性淋巴细胞白血病和/或B细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，所述急性淋巴细胞白血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种质粒组合，其中，所述质粒组合包含质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev，并且所述质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev的比例为2-6:1-1.5:1-3:1-1.5，其中所述质粒Seq1包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
20191217 CN 20191130151881.一种质粒组合，其中，所述质粒组合包含质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev，并且所述质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev的比例为2-6:1-1.5:1-3:1-1.5，其中所述质粒Seq1包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的质粒组合，其中所述质粒Seq1包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述核酸分子包含SEQIDNO.2所示的核酸序列。


3.根据权利要求1所述的质粒组合，其中所述质粒Seq1、PMD2.G、pMDLg-pRRE和pRSV-Rev的比例为11.8：3.53：6.33：2.3、13.8：3.48：5.31：2.54或14：4.67：4.67：4.67。


4.一种制备慢病毒载体的方法，所述方法包括将权利要求1-3中任一项所述的质粒组合导入细胞。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞是293T。


6.一种制备经修饰的免疫效应细胞的方法，所述方法包括根据权利要求4-5中任一项所述的方法制备得到慢病毒载体。


7.根据权利要求6所述的方法，其将所述慢病毒载体导入免疫效应细胞。


8.根据权利要求7所述的方法，所述免疫效应细胞选自以下组...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芸，石琳，吕璐璐，谢攀，曹蒙蒙，杨旺，杨家兴，王飞，王瑞，
申请(专利权)人：合源生物科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12