基于AAV的基因和蛋白质递送模块化系统技术方案

在一个实施方式中，本发明专利技术提供了包含外表面的腺相关病毒(AAV)，所述表面包含一个或多个肽标签，所述肽标签能与结合伴侣形成键，其中所述AAV是活病毒。在另一个实施方式中，本发明专利技术提供了一种偶联物，其包含至少一个该AAV和至少一个多肽，所述多肽包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域为针对标签的结合伴侣，所述第二结构域为生物活性多肽。在另一个实施方式中，本发明专利技术提供了一种偶联物，其包含至少一个该AAV(第一AAV)和至少一个第二AAV，其中该第二AAV包含第二外表面，该第二外表面包含至少一个针对所述标签的结合伴侣或针对第三接头分子的结合伴侣，其中所述至少一个第一AAV和所述至少一个第二AAV结合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于AAV的基因和蛋白质递送模块化系统相关申请的交叉引用本申请要求2018年2月28日提交的共同待批美国专利申请号62/636,638的权益，其全部内容通过引用全文纳入本文。电子化提交材料的参考纳入与本申请同时提交且如下认定的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表以其全文作为参考纳入本文：36,315字节ASCII(文本)文件，名为“741805_ST25.TXT”，提交日期为2019年2月28日。
技术介绍
目前，诸如腺相关病毒(AAV)的病毒是体内基因转移最有效的模式，但是它们却并不总是能够实现对蛋白质表达的瞬时控制。相反，通过病毒载体递送的基因通常是永久性表达的，这在持续表达会导致脱靶效应的情况(例如Cas9)中是一个明显的缺点。诱导型启动子能够提供一定水平的瞬态，但常有漏洞或效率低下。AAV是用于体内基因递送的高效非致病性载体，其对神经细胞有强趋向性，且易于在实验室环境中生产和工作。然而，AAV载体的大小被严格限制在4.7kB，禁止了大基因或多基因的递送。因此，需要基于AAV的改良载体系统，其能够实现比可容纳于单个AAV病毒体的转基因更大的转基因的递送。同时，还需要能够递送瞬时表达对其具有重要性的蛋白质(如Cas9)的基于AAV的载体。专利技术概述本专利技术基于AAV的安全性和效率提供了一种创新的基因和蛋白质递送系统，该系统克服了体内基因递送的这些主要障碍。为了克服包装尺寸的限制和永久性蛋白表达，本专利技术提供了一种基于AAV的基因和蛋白质模块化递送系统，该系统采用了能自发形成键(其非限制性的例子可为共价键)的肽标签，所述键在生理学相关条件下不会被小球状蛋白破坏。通过在AAV病毒体表面上表达该肽标签并在其他AAV或其他蛋白质上表达结合伴侣，本专利技术的AAV载体能够将衣壳彼此连接(例如共价连接)和/或将衣壳与蛋白质连接(例如共价连接)，产生更大的感染单位。这种用于将基因和蛋白质递送入细胞的高度灵活可扩展性模块化系统大大扩展了AAV的基因和蛋白质递送能力。本专利技术通过将AAV衣壳连接在一起形成偶联物，能够使AAV载体的运载能力翻倍(或多于翻倍)，使得大基因和多基因能够通过专性AAV共感染递送。而且，本专利技术通过将蛋白质拘于AAV衣壳外部，在递送必须瞬时表达的生物学活性蛋白质(如Cas9)的同时利用了病毒的趋向性和感染性。本专利技术还能扩展到这两种方式的结合，从而实现基因和蛋白质的成组的共递送。同时，该方式克服了体内基因和蛋白质递送的最重大的障碍，扩大了AAV介导的基因递送和基因编辑在生物学研究和基因治疗中的应用。重要的是，本专利技术的该系统是模块化、高度灵活的且能够针对各种各样试验目的进行改良。本专利技术该系统的开发对于生物学的所有领域均具有广泛的意义，通过提供用于精确有效地控制体内基因表达、基因编辑和蛋白质递送的可定制工具，为跨学科的科学家开辟了新的研究途径，并开辟了涉及大基因或需要瞬时表达的疾病治疗新途径。并且，本文的概念和方法是可扩展的，能够转用到其他类型的病毒。在一个实施方式中，本专利技术提供了包含外表面的腺相关病毒(AAV)，所述表面包含一个或多个肽标签，所述肽标签能与结合伴侣形成键(非限制性的例子为共价键)，其中所述AAV是活病毒。在另一个实施方式中，本专利技术提供了一种偶联物，其包含至少一个所述AAV和至少一个多肽，所述多肽包含第一结构域(其为所述标签的结合伴侣)和第二结构域(其为生物活性多肽)，其中所述AAV与所述多肽结合(例如共价结合)。在另一个实施方式中，本专利技术提供了一种偶联物，其包含至少一个此类AAV(第一AAV)和至少一个第二AAV，其中第二AAV包含第二外表面，该第二外表面包含至少一个针对所述标签的结合伴侣或针对第三接头分子的结合伴侣，其中所述至少一个第一AAV和所述至少一个第二AAV结合(例如，共价结合)，且其中所述至少一个第二AAV是活病毒。本专利技术还提供了用本专利技术的AAV和偶联物感染细胞的方法，以及包含本专利技术AAV和偶联物以及细胞的组合物，其中所述细胞被本专利技术的AAV或偶联物感染。本专利技术还提供了药物组合物，其包含本专利技术的AAV或偶联物以及药学上可接受的载剂。关于附图若干视图的简要说明依据关于涉及彩色附图的37C.F.R.§1.84的声明本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付所需费用之后由专利局提供。图1展示了本专利技术方式的示意图。A行涉及连接的病毒(AAV)。肽标签表达在AAV衣壳的表面上，而蛋白质结合伴侣则表达在另一病毒上(第二AAV)。将这两种病毒混合在一起，接头对能自动形成键(其非限制性例子可为共价键)，该键在生理学条件下是永久稳定的，从而形成偶联物(在A行中描绘为病毒二聚体)，提高载体的运载能力，并实现了对所递送基因比例的精确控制。偶联物能够将多个基因递送到同一细胞，或通过专性共感染传递大基因，然后再进行重组。B行涉及通过第三接头分子连接2个病毒衣壳，其中所述接头包含结合至两个病毒上的接头从而将两个载体桥接在一起的分子。C行涉及连接至病毒以形成偶联物的蛋白质。通过将蛋白质拘于衣壳外部，可利用AAV的趋向性和感染性来非永久性地递送治疗性蛋白，例如Cas9。Cas9的瞬时表达对于减少脱靶效应是很关键的。将连接的功能性蛋白递送入核，发挥它们的作用，然后降解。D行表示本专利技术的方式是如何扩展的。结合这些方法，任何含DNA病毒颗粒和蛋白质串可作为多聚偶联物单元被一起递送。图2展示了连接的载体(AAV偶联物)的电子显微镜照片。分图A显示作为对照的AAV2载体。分图B展示了证明AAV2-SpyTag载体与AAV2-SnoopTag载体连接形成多病毒偶联物的数据。偶联物表现为AAV病毒体的二聚体或三聚体。分图C显示了SpyTag/SnoopTag接头的过表达导致形成AAV衣壳簇，其中许多AAV载体系连在一起。图3描绘了显示AAV衣壳连接的Western印迹图像。最后两个泳道中的上方条带指示了连接的VP3亚单位。在该具体实施方式中，AAV衣壳通过第三连接分子连接((VP3SpyTag-接头-VP3SnoopTag)(图1，B行)。图4图示了包含连接于功能性蛋白的AAV的偶联物。分图A描绘了增量的GFP-SpyCatcher与AAV-SpyTag连接。分图B描绘了tdTomato(由包装入AAV2的转基因编码)的表达，证明了AAV-SpyTag-GFP-SpyCatcher是感染性的。分图C展示的数据证明AAV-SpyTag-GFP-SpyCatcher颗粒能够通过超分辨率共聚焦显微技术追踪，证明了功能性蛋白的成功掺入。图5展示了涉及AAV-多肽偶联物的数据，在该偶联物中Cas9-SpyCatcher共价结合于AAV2-SpyTag。分图A涉及用Cas9-Spycatcher和靶向视紫红质的向导RNA转染的HEK293T细胞。CRISPR/Cas9诱导的突变用T7分析来测试。前两个泳道显示1)未处理和2)用T7核酸内切酶处理的未转染样品。最后两个泳道显示3)未处理和4)用T7核酸内切酶处理的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含外表面的腺相关病毒(AAV)，所述表面包含一个或多个肽标签，所述肽标签能与结合伴侣形成键，其中所述AAV是活病毒。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180228 US 62/636,6381.包含外表面的腺相关病毒(AAV)，所述表面包含一个或多个肽标签，所述肽标签能与结合伴侣形成键，其中所述AAV是活病毒。


2.一种偶联物，其包含权利要求1所述的AAV和至少一个多肽，所述多肽包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包含针对所述标签的结合伴侣，所述第二结构域包含生物活性多肽，其中所述AAV和所述多肽结合。


3.如权利要求2所述的偶联物，其中，所述第二结构域包括Cas9。


4.一种偶联物，其包含至少一个权利要求1所述的AAV(第一AAV)和至少一个第二AAV，其中第二AAV包含第二外表面，该第二外表面包含针对所述标签或针对第三接头分子的至少一个结合伴侣，其中所述至少一个第一AAV和所述至少一个第二AAV结合，且其中所述至少一个第二AAV是活病毒。


5.如权利要求4所述的偶联物，其中，所述偶联物中的第一AAV和第二AAV包含基因组，所述基因组包含转基因的分开的相应片段，从而在用所述偶联物感染细胞时可组装成完整的转基因。


6.如权利要求4或5所述的偶联物，其中，所述至少一个第一AAV的外表面包含针对肽标签的至少一个结合伴侣，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·拜恩，B·E·奥兹图科，T·戴，
申请(专利权)人：匹兹堡大学联邦系统高等教育，加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US