治疗肢带型肌营养不良2A型的重组腺相关病毒产品和方法技术

本发明专利技术提供了用于治疗肢带型肌营养不良2A型的产品和方法。在所述方法中，重组腺相关病毒递送编码具有钙蛋白酶3活性的蛋白质的DNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗肢带型肌营养不良2A型的重组腺相关病毒产品和方法本申请要求2018年6月29日提交的美国临时专利申请号62/691,934和2019年6月21日提交的美国临时专利申请号62/865,081的优先权，每个专利申请以引用的方式整体并入本文。
本文提供了用于治疗肢带型肌营养不良2A型的产品和方法。在这些方法中，重组腺相关病毒递送编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的DNA。序列表以引用的方式并入作为公开的单独部分，本申请含有计算机可读形式的序列表(文件名：52684P2_SeqListing.txt；23,755字节–ASCII文本文件，创建于2019年6月26日)，所述序列表以引用的方式整体并入本文。
技术介绍
肌营养不良(MD)是一组遗传性疾病。该组的特征在于控制运动的骨骼肌进行性无力和退化。一些形式的MD发生在婴儿期或儿童期，而另一些则可能直到中年或更晚时期才出现。所述障碍在肌无力的分布和程度(一些形式的MD还会影响心肌)、发病年龄、进展速率和遗传方式方面有所不同。一组MD是MD的肢带组(LGMD)。LGMD是一种罕见的病症，并且它们在发病年龄、肌无力的区域、心脏和呼吸器官受累、进展速率和严重性方面在不同人群中的表现不同。LGMD可以开始于儿童期、青春期、成年早期甚至更晚。两个性别受影响情况相等。LGMD导致肩膀和骨盆带无力，有时在大腿上部和手臂附近的肌肉也会随着时间而虚弱。腿部无力通常在手臂无力之前出现。面部肌肉通常不受影响。随着病症进展，人们可能具有行走问题并随着时间的推移可能需要使用轮椅。肩膀和手臂肌肉的受累可能导致难以举起手臂超过头顶和难以举起物体。在一些类型的LGMD中，心脏和呼吸肌可能受累。存在至少十九种形式的LGMD，并且这些形式根据其相关的遗传缺陷进行分类。LGMD的专门测试现在可通过国家诊断方案(国家委任小组(NCG))获得。钙蛋白酶3基因(CAPN3)的突变导致全世界最常见的肢带型肌营养不良症之一LGMD2A。目前，尚无这种遗传疾病的治疗方法。先前的研究已经证明了CAPN3基因转移以纠正CAPN3缺陷小鼠的病理体征的潜力。然而，由结蛋白启动子驱动的CAPN3的表达导致心脏毒性[Bartoli等人,Mol.Ther.,13:250-259(2006)]。在后续研究中，研究了所述基因的骨骼肌表达[Roudaut等人,Circulation,128:1094-1104(2013)]。腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度为约4.7kb，包括两个145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。有多种AAV血清型。AAV血清型基因组的核苷酸序列是已知的。例如，在GenBank登录号NC_002077中提供了AAV-1的完整基因组；在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,J.Virol.,45:555-564{1983)中提供了AAV-2的完整基因组；在GenBank登录号NC_1829中提供了AAV-3的完整基因组；在GenBank登录号NC_001829中提供了AAV-4的完整基因组；在GenBank登录号AF085716中提供了AAV-5基因组；在GenBank登录号NC_001862中提供了AAV-6的完整基因组；在GenBank登录号AX753246和AX753249中分别提供了AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分；在Gao等人,J.Virol.,78:6381-6388(2004)中提供了AAV-9基因组；在Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)中提供了AAV-10基因组；并且在Virology,330(2):：375-383(2004)中提供了AAV-11基因组。在美国专利9,434,928中提供了AAVrh.74基因组的序列，所述美国专利以引用的方式并入本文。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在AAVITR内。三个AAV启动子(因其相对图谱位置而命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)加上单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)导致从所述rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。Rep蛋白拥有最终负责复制病毒基因组的多种酶促特性。cap基因从p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代的剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单个共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。在Muzyczka,CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,158:97-129(1992)中综述AAV的生命周期和遗传学。AAV拥有独特的特征，所述特征使其成为例如在基因治疗中将外源DNA传递至细胞的载体具有吸引力。培养物中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人类和其他动物的自然感染是沉默的且无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而允许在体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂的细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)在那些细胞的生命周期中基本上持续存在。将AAV前病毒基因组作为克隆DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制和基因组衣壳化的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此基因组的内部大约4.3kb的一些或全部(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可能被外源DNA替换。为了产生AAV载体，可以反式提供rep和cap蛋白。AAV的另一个显著特征是它是一种非常稳定且旺盛的病毒。它容易地承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃持续数小时)，从而使AAV的冷藏变得不那么关键。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞对重复感染没有抵抗力。本领域仍然需要针对LGMD2A的治疗。
技术实现思路
本文提供了用于递送编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的DNA的方法和产品。此类方法和产品可以用于治疗各种疾病，例如LGMD2A。提供了编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的重组腺相关病毒(rAAV)。所述重组腺相关病毒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列。编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列例如与SEQIDNO:2至少90％相同，或包含SEQIDNO:2的序列。例如，所提供的rAAV包含多核苷酸，所述多核苷酸包含第一AAV反向末端重复序列(ITR)、启动子、编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的核苷酸序列和第二AAVITR。例如，编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列与SEQIDNO:2至少90％相同、或者与SEQIDNO:2至少91％相同、与SEQIDNO:2至少92％相同、与SEQIDNO:2至少93％相同、与SEQIDNO:2至少94％相同、与SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)，所述多核苷酸包含第一AAV反向末端重复序列(ITR)、启动子、编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的核苷酸序列和第二AAV ITR。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180629 US 62/691934;20190621 US 62/8650811.一种包含多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)，所述多核苷酸包含第一AAV反向末端重复序列(ITR)、启动子、编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的核苷酸序列和第二AAVITR。


2.根据权利要求1所述的rAAV，其中编码所述具有CAPN3活性的蛋白质的所述核苷酸序列与SEQIDNO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。


3.根据权利要求1或2所述的rAAV，其中编码所述具有CAPN3活性的蛋白质的所述核苷酸序列与SEQIDNO:2至少95％相同。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的rAAV，其中编码所述具有CAPN3活性的蛋白质的所述核苷酸序列包含SEQIDNO:2的序列。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的rAAV，其中所述具有CAPN3活性的蛋白质包含与SEQIDNO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。


6.根据权利要求1-4中任一项所述的rAAV，其中所述具有CAPN3活性的蛋白质包含与SEQIDNO:7至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。


7.根据权利要求1-4中任一项所述的rAAV，其中所述具有CAPN3活性的蛋白质包含SEQIDNO:7的氨基酸序列。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的rAAV，其中所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。


9.根据权利要求1-7中任一项所述的rAAV，其中所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1至少95％相同的序列。


10.根据权利要求1-7中任一项所述的rAAV，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的序列。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的rAAV，其中所述启动子是肌肉特异性启动子。


12.根据权利要求11所述的rAAV，其中所述肌肉特异性启动子包含以下中的一种或多种：人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、结蛋白启动子、骨骼α肌动蛋白(ASKA)启动子、肌钙蛋白I(TNNI2)启动子、肌细胞特异性增强子结合因子mef结合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、截短的MCK(tMCK)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、杂合a肌球蛋白重链增强子/MCK增强子启动子(MHCK7)启动子、C5-12启动子、鼠类肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、低氧诱导核因子(HIF)-反应元件(HRE)、类固醇诱导元件和糖皮质激素反应元件(gre)。


13.根据权利要求11所述的rAAV，其中所述肌肉特异性启动子是MCK启动子、tMCK启动子或MHCK7启动子。


14.根据权利要求11所述的rAAV，其中所述肌肉特异性启动子是包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的截短的MCK启动子。


15.根据权利要求1-14中任一项所述的rAAV，其中所述第一AAV反向末端重复序列和第二AAV反向末端重复序列是AAV2反向末端重复序列。


16.根据权利要求1-15中任一项所述的rAAV，其中所述rAAV包含以下中的一种或多种：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAVrh.74和AAVrh.10衣壳蛋白。


17.根据权利要求16中任一项所述的rAAV，其中所述rAAV包含rh.74衣壳蛋白或AAV9衣壳蛋白。


18.一种组合物，其包含根据权利要求1-17中任一项所述的rAAV。


19.一种治疗受试者的肢带型肌营养不良2A型的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的rAAV或根据权利要求18所述的组合物。


20.根据权利要求19所述的方法，其中所述治疗导致以下中的一种或多种：
(a)肌纤维直径增加；
(b)小叶状肌纤维数量减少；
(c)具有内核的纤维数量减少；
(d)肌内膜结缔组织含量降低；
(e)肌肉萎缩的矫正，和
(f)肌力产生增加。


21.根据权利要求20所述的方法，其中所述肌纤维包含以下中的一种或多种：慢缩氧化(STO)肌纤维、快缩氧化(FTO)肌纤维和快缩糖酵解(FTG)纤维。


22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述治疗导致以下中的一种或多种：
(a)施用后4周每mm2的总肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％或40％；
(b)施用后4周肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；
(c)施用后4周每mm2的STO肌纤...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z·萨亨克，
申请(专利权)人：全国儿童医院研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US