靶向肌肉疾病中肌肉的优化基因疗法制造技术

本公开提供了基因治疗载体，诸如腺相关病毒(AAV)，其经过优化以用于将转基因递送至肌肉。优化的载体含有：组成型或肌肉特异性启动子，分别用于递送全身或骨骼肌/心肌特异性转基因表达，并与转基因cDNA结合，用正常基因拷贝替换肌肉疾病中发现的基因突变；内部核糖体进入位点(IRES)，以允许从同一转录物中产生第二种蛋白质；以及肌肉生长因子，用于建立新的肌肉生长和力量。例如，本公开提供了基因治疗载体，诸如重组腺相关病毒(rAAV)，其被设计成用于治疗GNE肌病，其中rAAV单独或与肌肉生长因子或肌肉转分化因子结合表达UDP

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向肌肉疾病中肌肉的优化基因疗法
[0001]本申请要求于2019年12月20日提交的美国临时专利申请第62/951,564号的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
[0002]以电子方式提交的材料通过引用并入
[0003]本申请含有作为本公开内容的单独部分的计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用以其整体并入本文且标识如下：创建于2020年12月21日的名称为“54649_Sqlisting.txt”的一份233,379字节的文件。


[0004]本公开提供了基因治疗载体，诸如腺相关病毒(AAV)，其经过优化以用于将转基因递送至肌肉。优化的载体含有：组成型或肌肉特异性启动子，分别用于递送全身或骨骼肌/心肌特异性转基因表达，并与转基因cDNA结合，用正常基因拷贝替换肌肉疾病中发现的基因突变；内部核糖体进入位点(IRES)，以允许从同一转录物中产生第二种蛋白质；以及肌肉生长因子，用于建立新的肌肉生长和力量。转基因和肌肉生长因子基因由同一mRNA表达，由于成纤维细胞生长因子1A基因序列中内部核糖体进入位点(或IRES)的存在，该mRNA表达两种蛋白质，这允许第二种蛋白质由单个mRNA制成。

技术介绍

[0005]GNE肌病是一种成人发病的常染色体隐性遗传病，其特征是进行性肌肉无力，可导致丧失行走能力和丧失独立生活能力。顾名思义，GNE肌病是由GNE基因功能丧失致病变异或突变引起的。这种疾病也被称为遗传性包涵体肌病、保留股四头肌肌病、远端型肌病伴镶边空泡和野中广务(Nonaka)肌病。GNE基因编码双功能UDP
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GlcNAc
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差向异构酶/ManNAc
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6激酶，其酶活性在唾液酸生物合成途径中是必不可少的。
[0006]唾液酸是酸性单糖，可修饰糖蛋白和糖脂上的非还原末端碳水化合物链，在不同过程中诸如细胞粘附和细胞相互作用发挥重要作用。唾液酸与健康和疾病有关，并且存在于调节它们的细胞功能的蛋白质的末端糖链中。UDP
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N
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乙酰氨基葡萄糖2
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差向异构酶/N
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乙酰甘露糖激酶(GNE)是唾液酸生物合成的关键酶。此外，已经证明当肌纤维受损或再生时会诱导GNE表达，并且GNE在肌肉再生中起作用。携带突变的GNE基因的成肌细胞表现出它们的差向异构酶活性的降低，因此携带纯合差向异构酶突变的细胞也仅表现出总膜结合唾液酸的显著降低。(Pogoryleva等人,《罕见病孤儿杂志(Orphanet J Rare Dis.)》13:70,2018)。
[0007]GNE肌病导致腿部和手臂肌肉无力和消瘦。首发症状通常发生在年轻人身上(通常在生命中的第三个十年)，但在一些患者中也已观察到较晚发作。GNE肌病的诊断应主要考虑在成年早期出现远端无力(足下垂)的患者(也可能出现其他症状)。该疾病缓慢进展至其他下肢和上肢肌肉，通常会明显保留股四头肌。在受影响肌肉的活检中发现的特征性发现包含“镶边”(自噬)空泡、各种蛋白质的聚集和纤维大小的变化。
[0008]尽管GNE基因的突变在2001年被证明会导致GNE肌病，但目前还没有针对这种疾病
的有效疗法。开发缓释唾液酸疗法的尝试在3期临床试验中失败，目前正在研究ManNAc聚糖疗法。虽然开发用于GNE基因替代的基因治疗方法似乎很简单，但实际上它因GNE肌病研究中的许多未解决问题而变得复杂：首先，该疾病缺乏稳健且可重复的模型。虽然Noguchi和Nishino发表了几篇关于转基因GNED176VTg Gne
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小鼠模型的论文，该模型显示了疾病病理学的清晰方面，但其他群体在随后的培育中未能看到相同的表型，这可能是奠基者转基因品系中遗传漂移的结果(参见Nishino等人,《神经病学.神经外科学.精神病学杂志(J.Neurol.Neurosurg，Psychiatry)》86(4):385
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392)。GNE
M712T
变异敲入小鼠模型显示在生命的最初几周内因肾脏疾病而过早死亡，这是一种在GNE肌病患者中不存在的临床表型。尽管具有相同的基因突变，但培育出相同模型的其他品系根本没有表现出任何表型。其次是缺乏来自罕见且地理多样化的患者群体的可测量的自然史数据。第三，由于疾病进展较晚，仅通过基因置换的GNE肌病试验很难显示临床效果，这只会减缓或阻止疾病进展。
[0009]缺乏GNE活性的细胞可以通过添加唾液酸(SA)或通过添加ManNAc来挽救，后者也可以通过在疾病中未发生突变的GlcNAc
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6激酶活性转化为GNE活性的最终产物ManNAc
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6磷酸盐。一些聚糖疗法已在GNED176VTgGne
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小鼠和Gne
M712T
敲入小鼠中显示出疗效。这已产生了两组临床试验，一组使用缓释SA(第3阶段完成)(Lochmuller等人,《神经病学(Neurology)》92(18):e2109
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e17，2019)和一组使用ManNAc(第1阶段完成)(Xu等人,《分子遗传学和代谢(Mol.Genet.Metab.)》,12291
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2:126
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34,2017)。虽然SA和ManNAc在小鼠中显示出显著的治疗效果，但在GNE肌病患者的3期临床试验中，缓释SA疗法(ACE
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ER)没有达到临床里程碑[16]。对于任何临床测量，与安慰剂相比没有显著变化。
[0010]GNE肌病患者中聚糖治疗缺乏疗效使得基因治疗成为非常有吸引力的替代方案。然而，仍然存在一个主要问题，即人类疾病进展缓慢且多变，并且缺乏稳健的短期临床里程碑。例如，当前的3期临床试验持续时间为48周[16]。在这段时间里，患者群体的任何强度测量值与治疗前基线相比都没有显著下降，尽管一些测量值确实呈下降趋势。
[0011]本文提供的GNE治疗方法的目标是创建串联基因疗法——利用肌肉特异性IRES来创建表达正常GNE基因和已知肌肉生长因子的双顺反子基因治疗载体。这样的AAV载体既能纠正GNE肌病的遗传缺陷，又能增加肌肉力量，从而逆转而不是仅仅阻止肌肉力量临床指标的下降。建立新的肌肉和肌肉力量，同时通过添加正常GNE基因来预防进一步疾病的疗法将对GNE肌病患者有更大的益处，并将提供一种更容易证明临床改进的方法。
[0012]鉴于该疾病的病理生理学，最近的临床试验评估了唾液酸或ManNAc(唾液酸的前体)在GNE肌病患者中的使用以及早期基因治疗试验。例如，携带野生型人GNE cDNA的AAV8病毒载体已被证明可以转导培养的鼠肌肉细胞和人GNE肌病衍生的肌肉细胞，并在这些细胞中表达转基因(Mitrani
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Rosenbaum等人,《神经肌内失调(Neuromuscul.Disord.)》,22(11):1015
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多核苷酸，其包含a)启动子元件，b)转基因，c)内部核糖体进入位点(IRES)，和d)编码肌肉生长因子或肌肉转分化因子的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述启动子元件与所述转基因可操作地连接。3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述IRES与所述编码肌肉生长因子或肌肉转分化因子的核苷酸序列可操作地连接。4.一种多核苷酸，其包含：a)一种或多种启动子元件，和b)GNE cDNA序列。5.一种多核苷酸，其包含：a)一种或多种启动子元件，b)GNE cDNA序列或GALGT2 cDNA序列，c)内部核糖体进入位点(IRES)，和d)编码肌肉生长因子或肌肉转分化因子的核苷酸序列。6.根据权利要求4或5所述的多核苷酸，其中所述启动子元件与所述GNE cDNA序列或所述GALGT2 cDNA序列可操作地连接。7.根据权利要求5或6所述的多核苷酸，其中所述IRES与所述编码肌肉生长因子或肌肉转分化因子的核苷酸序列可操作地连接。8.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子元件是组成型启动子或肌肉特异性启动子。9.根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子元件是CMV启动子、MCK启动子、MHCK7启动子、迷你CMV启动子或GNE启动子。10.根据权利要求4至9中任一项所述的多核苷酸，其中所述GNE cDNA序列是包含SEQ ID NO:1的核酸序列的变体2GNE野生型人GNE基因。11.根据权利要求4至10中任一项所述的多核苷酸序列，进一步包含在外显子1和2之间发现的所述人GNE启动子元件以驱动所述GNE cDNA的表达。12.根据权利要求5至10中任一项所述的多核苷酸序列，其中所述GALGT2 cDNA序列包含SEQ ID NO:36的核酸序列。13.根据权利要求1至12中任一项所述的多核苷酸，其中所述内部核糖体进入位点(IRES)来自成纤维细胞生长因子1A基因。14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述IRES包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列或其片段。15.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述IRES包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。16.根据权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码卵泡抑素、SMAD7或胰岛素生长因子1(IGF1)变体。17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述卵泡抑素是卵泡抑素344或卵泡抑素314。
18.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述IGF1变体是HB
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IGF1。19.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其基因组包含权利要求1至18中任一项所述的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸处于单个rAAV基因组中。20.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述基因组包含CMV启动子和变体2野生型人GNE cDNA。21.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述基因组包含MCK启动子和变体2野生型人GNE cDNA。22.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述基因组包含MHCK启动子和变体2野生型人GNE cDNA。23.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述基因组包含GNE启动子和变体2野生型人GNE cDNA。24.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述基因组包含迷你CMV启动子和变体2野生型人GNE cDNA。25.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述基因组包含MCK7启动子、变体2野生型人cDNA、FGF1 IRES和编码卵泡抑素344的核酸序列。26.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述基因组包含MHCK7启动子、变体2野生型人GNE cDNA、FGF1 IRES和编码HB
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IGF1的核酸序列。27.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述基因组包含所述CMV启动子、变体2野生型人GNE cDNA、FGF1 IRES和编码卵泡抑素344的核酸序列。28.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述基因组包含所述CMV启动子、变体2野生型人GNE cDNA、FGF1 IRES和编码HB

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：全国儿童医院研究所，
类型：发明
国别省市：