利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒在中枢神经系统转导效率的方法技术方案

本发明专利技术提供了一种利用细胞穿膜肽（CPPs）增强腺相关病毒9型转导效率的方法，可用于增强载体将转基因递送至患者的中枢神经系统（CNS）的能力。通过施用CPPs和重组腺相关病毒9型（rAAV9），可以提高rAAV9穿过血脑屏障（BBB）的效率，并且极大的提高了转基因在中枢神经系统的表达，同时能够避免出现过度的免疫反应，大大拓展了药物制剂向脑和/或中枢神经系统的细胞递送核酸的临床前景。

【技术实现步骤摘要】
利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒在中枢神经系统转导效率的方法
本专利技术涉及一种促进病毒载体转导效率方法，具体涉及一种利用细胞穿膜肽促进AAV9在中枢神经系统基因表达的方法，属于基因工程

技术介绍
重组腺相关病毒（recombinationadeno-associatedvirus,rAAV）已在基因治疗领域广泛使用了数十年，并已广泛用于眼部疾病，癌症和血管疾病等，但是由于其通过血脑屏障（blood–brainbarrier,BBB）传递rAAV载体的效率非常低，其在中枢神经系统（CNS）疾病治疗中的应用受到严重限制。血脑屏障是一种高度选择性的渗透屏障，可将循环血液与中枢神经系统的脑细胞外液分开，并阻止大多数药物从血液进入大脑。它由毛细血管内皮细胞形成。星形胶质细胞是哺乳动物脑中神经胶质细胞的主要类型，并且是形成血脑屏障所必需的。它们为中枢神经系统中的伙伴神经元提供多种支持功能，例如发育过程中的神经元指导以及终生的营养和代谢支持。已经有许多研究致力于提高大脑中AAV载体的转导效率，但是目前为止这方面的进展仍旧非常有限。一些临床前研究表明，工程化的AAV载体显示出积极的结果，但进一步的研究发现，这些AAV载体可能无法增强大型动物和人类体内的转导效率。目前尚不清楚病毒衣壳上的突变是否会影响其生产能力，以及是否会导致任何安全隐患，并且AAV工程既费时又费钱。因此，有必要寻找一种有效且经济的策略来改善CNS中的AAV转导效率。据报道，细胞穿膜肽（Cell-penetratingpeptides,CPPs）可以在体内和体外增强AAV2和AAV8的转导，并且在体内没有检测到CPPs的细胞毒性。过去的研究已知THR肽能够增加AAV8在大脑中的BBB穿越能力和转导效率，但是与全身注射AAV8/多肽后的大脑相比，在肝脏中发现的AAV8病毒体数量要多得多（约175倍），即AAV8是具有高度肝向性的载体（ZhangX,HeT,ChaiZ,SamulskiRJ,andLiC.Biomaterials.2018;176:71-83），该结果表明AAV8不是将靶基因递送至大脑的理想AAV载体。尽管CPPs可以增强AAV定向转导，但是CPPs是否能够改变向量的向性是未知的。LAH4是一种與磷脂膜强烈相互作用并能够吸附在膜上的抗菌肽，介导功能性β-半乳糖苷酶向细胞内部的转运，具有很高的核酸转染效率及细胞渗透活性，目前已经开发出相关的衍生物以增强病毒转导用于基因治疗。Leptin30是源自内源性激素leptin的30个氨基酸的肽，被用作脑靶向配体，特异性的配体-受体结合介导的内吞作用被认为是克服血脑屏障障碍的可能策略之一。ApoE是一种在外周和中枢神经系统（CNS）中分泌的脂质转运蛋白，目前也已经有将其作为血脑屏障受体靶向剂的研究。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒9型转导效率的方法，以克服现有技术中的不足。为实现前述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供一种将转基因递送至中枢神经系统的方法，该方法包括施用：（i）细胞穿膜肽，前述细胞穿膜肽选自LAH4、LEPTIN30、APOE或其组合；（ii）重组腺相关病毒载体。优选地，上述重组腺相关病毒载体是腺相关病毒9型或其任何突变体。更优选地，上述腺相关病毒9型包含鸡β-肌动蛋白启动子。优选地，上述LAH4包含SEQIDNO：1的序列。优选地，上述APOE包含SEQIDNO：2的序列。优选地，上述LEPTIN30包含SEQIDNO：3的序列。优选地，上述腺相关病毒9型和细胞穿膜肽形成复合物。优选地，上述重组腺相关病毒载体能够穿过血脑屏障。优选地，上述转基因能够在人脑内皮细胞和神经胶质细胞中表达。在另一实施方案中，本专利技术还提供一种组合物，该组合物包含上述的细胞穿膜肽和重组腺相关病毒载体。优选地，上述组合物还包含药学上可接受的载体。本专利技术还提供前述组合物于治疗患者中枢神经系统疾病中的应用。本专利技术中发现了数种细胞穿膜肽（CPP）可以显着增强腺相关病毒9型（AAV血清型9，AAV9）的体外转导效率，这是一种用于治疗CNS疾病的有前途的AAV载体。在具体的实施方案中，使转导效率提升最多的是LAH4肽，并且LAH4肽对AAV9转导效率的增强是剂量依赖的，其依赖于AAV9衣壳与肽的结合。此外，还证明了全身给药后，LAH4肽增加了CNS内的AAV9转导。本专利技术提供的CPP可以直接与AAV9相互作用，并增强该AAV载体穿越BBB的能力，从而进一步诱导脑中基因的更高表达，有助于改善AAV基因传递载体在中枢神经系统疾病治疗中的应用。如上所述，由CPPs介导的病毒转导效率增强是由AAV颗粒与CPPs之间的直接相互作用引起的，因此，纯化的AAV-CPP复合物将比未纯化的混合物具有更高的效率、更好的安全性和更低的免疫反应。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的利用细胞穿膜肽促进AAV介导的外源基因在中枢神经系统的表达能力的方法，利用细胞穿膜肽的特性，将其与AAV介导的基因治疗联合起来，携带AAV到达一些难以透过的区域，提高基因表达效率。本专利技术可以提高rAAV9穿过血脑屏障（BBB）的效率，并且极大的提高了转基因在中枢神经系统的表达，同时能够避免出现过度的免疫反应，对推动基因治疗、细胞治疗、细胞工程等领域发展有着至关重要的意义。定义重组AAV：术语“重组AAV”是指已经从其天然环境（例如从宿主细胞、组织或受试者）分离的AAV或人工产生的AAV，使用重组方法产生重组的AAV。重组AAV（rAAV）优选具有组织特异性靶向能力，使得rAAV的转基因将被特异性递送至一个或多个预定组织。转染：术语“转染”指的是细胞吸收外来DNA，当外源DNA被引入细胞膜内时，细胞即被“转染”。许多转染技术是本领域公知的（参见如Graham等人(1973)Virology,52:456、Sambrook等人(1989)MolecularCloning,alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork、Davis等人(1986)BasicMethodsinMolecularBiology,Elsevier，和Chu等人(1981)Gene13:197），这些技术可用于将一种或多种外源核酸，如核苷酸整合载体和其它核酸分子引入合适的宿主细胞中。载体：术语“载体”包括任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等，其在与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。在一些实施方案中，有用的载体被认为是其中待转录的核酸片段位于启动子的转录控制下的那些载体。术语“启动子”是指引发基因的特异性转录需要的通过细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将转基因递送至中枢神经系统的方法，其特征在于，所述方法包括施用：/n（i）细胞穿膜肽，所述细胞穿膜肽选自LAH4、LEPTIN30、APOE或其组合；/n（ii）重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体是腺相关病毒9型或其任何突变体。/n

【技术特征摘要】
1.一种将转基因递送至中枢神经系统的方法，其特征在于，所述方法包括施用：
（i）细胞穿膜肽，所述细胞穿膜肽选自LAH4、LEPTIN30、APOE或其组合；
（ii）重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体是腺相关病毒9型或其任何突变体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LAH4包含SEQIDNO：1的序列。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述APOE包含SEQIDNO：2的序列。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LEPTIN30包含SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗光佐，韩雪飞，孟缘，
申请(专利权)人：南京贝思奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32