一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV基因药物的系统及方法技术方案

本发明专利技术涉及一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的系统，其包括：第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒和Sf9细胞；第一杆状病毒的基因组上整合了编码Rep78蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP2的表达盒，其中编码Rep78蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP2的基因由p10启动子驱动表达；第二杆状病毒的基因组上整合了编码Rep52蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP1的表达盒，其中编码Rep52蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP1的基因由p10启动子驱动表达；第三杆状病毒的基因组上整合了携带目的基因表达盒的AAV载体序列；利用第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒共同感染Sf9细胞生产携带目的基因的AAV。

【技术实现步骤摘要】
一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV基因药物的系统及方法
本专利技术涉及基因药物
，尤其涉及一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV基因药物的系统及方法。
技术介绍
腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一，是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.70kb左右的线状单链DNA基因组。基于AAV设计的重组腺相关病毒是一种重要的基因治疗载体，具有安全可控性。AAV作为一种复制缺陷型DNA病毒，其复制需辅助病毒共感染完成。基因组结构如图1所示。在构建rAAV的过程中，WtAAV的rep和cap基因被用于研究的目的基因的表达系统所代替，只保留了AAV基因组两端的两个ITRs。ITRs在rAAV的复制、包装过程中具有重要的生物功能，是rAAV载体必备的DNA序列。构建包含目的基因的重组病毒载体，且易于高效生产是研发rAAV介导的基因治疗药物的基础。目前广为采用的生产rAAV的方法之一是三质粒共转染法，即用目的基因和相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的系统，其特征在于，包括：第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒和Sf9细胞；/n第一杆状病毒的基因组上整合了编码Rep78蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP2的表达盒，其中编码Rep78蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP2的基因由p10启动子驱动表达；/n第二杆状病毒的基因组上整合了编码Rep52蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP1的表达盒，其中编码Rep52蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP1的基因由p10启动子驱动表达；/n第三杆状病毒的基因组上整合了携带目的基因表达盒的AAV载体序列；/...

【技术特征摘要】
1.一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的系统，其特征在于，包括：第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒和Sf9细胞；
第一杆状病毒的基因组上整合了编码Rep78蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP2的表达盒，其中编码Rep78蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP2的基因由p10启动子驱动表达；
第二杆状病毒的基因组上整合了编码Rep52蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP1的表达盒，其中编码Rep52蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP1的基因由p10启动子驱动表达；
第三杆状病毒的基因组上整合了携带目的基因表达盒的AAV载体序列；
利用第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒共同感染Sf9细胞生产携带目的基因的AAV。


2.一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的方法，其特征在于，包括：
S1:将编码Rep78蛋白和编码Rep52蛋白的两个表达盒的其中之一与编码Cap蛋白VP2的表达盒相连克隆到第一杆状病毒载体上，分别用polyhedrin和p10启动子驱动，得到第一杆状病毒；
将编码Rep78蛋白和编码Rep52蛋白的两个表达盒的另一个与编码Cap蛋白VP1的表达盒相连克隆到第二杆状病毒载体上，分别用polyhedrin和p10启动子驱动，得到第二杆状病毒；
S2:将携带目的基因表达盒的AAV载体序列克隆到第三杆状病毒载体上，得到第三杆状病毒；
S3:贴壁培养Sf9细胞，在需要产AAV病毒时，利用第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒共感染Sf9细胞，生产携带目的基因的AAV。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，第三杆状病毒的基因组上整合了质粒序列pFast-Bac-AAV-TargetGene，其中TargetGene表示目的基因，AAV为腺相关病毒的表达盒序列；第三杆状病毒的制备方法为：构建pFast-Bac-AAV-TargetGene质粒载体，将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-AAV-TargetGene；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-AAV-TargetGene转染贴壁的Sf9细胞，得到所述第三杆状病毒。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述TargetGene为SMN1基因，其序列如SEQIDNo:7所示；或者，所述TargetGene为编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列SEQIDNo:8或SEQIDNo:9。


5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中，将编码Rep78蛋白与编码Cap蛋白VP2的表达盒相连克隆到第一杆状病毒载体上，得到第一杆状病毒；将编码Rep52蛋白与编码Cap蛋白VP1的表达盒相连克隆到第二杆状病毒载体上，得到第二杆状病毒；
第一杆状病毒的制备方法为：构建pFast-Bac-dual-Rep78/VP2质粒载体，该质粒载体中含p10-VP2-polyhedrin-Rep78序列(如SEQIDNo:6所示)；将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2转染贴壁的Sf9细胞，得到所述第一杆状病毒；
第二杆状病毒的制备方法为：构建pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体，该质粒载体中含p10-VP1-polyhedrin-Rep52序列(如SEQIDNo:5所示)；将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1转染贴壁的Sf9细胞，得到所述第二杆状病毒。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
S1中，构建pFast-Bac-dual-Rep78/VP2与pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体的方法为：
步骤1：将pFast-Bac-dual质粒用限制性内切酶进行双酶切处理后，琼脂糖电泳后切胶回收pFast-Bac-dual载体片段，将pFast-Bac-dual载体片段分别与编码VP2和编码VP1的基因片段采用连接酶连接；
将连接产物转化感受态DH5a，经混匀、冰浴、热休克后再立即并浴，先用无抗生素的液体培养基培养后，再转入含有氨苄青霉素的琼脂平板上继续培养，之后挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素液体培养液中振荡培养，提取质粒并进行双酶切鉴定后进行测序鉴定，分别对应获得pFast-Bac-dual-VP2质粒和pFast-Bac-dual-VP1质粒；
步骤2：将pFast-Bac-dual-VP2质粒和pFast-Bac-dual-VP1质粒分别用限制性内切酶进行双酶切后，分别进行琼脂糖电泳后切胶回收pFast-Bac-dual-VP2载体片段和pFast-Bac-dual-VP1载体片段；
将pFast-Bac-dual-VP2载体片段与编码Rep78的基因片段连接，将pFast-Bac-dual-VP1载体片段与编码Rep52的基因片段采用连接酶连接；
将连接产...

【专利技术属性】
技术研发人员：董文吉，刘子瑾，赵忠亮，曹帆，程谟斌，张艳君，
申请(专利权)人：中吉智药南京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32