一种表达人GM-CSF的重组溶瘤新城疫病毒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物病毒构建领域，具体公开了一种表达人GM

【技术实现步骤摘要】
一种表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒及其应用


[0001]本专利技术属于生物病毒构建领域，具体涉及一种表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒及其应用。

技术介绍

[0002]溶瘤病毒(oncolytic virus)是指一类能够特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，利用溶瘤病毒对肿瘤进行治疗是肿瘤生物治疗的研究热点之一。溶瘤病毒主要通过2种机制实现对肿瘤的杀伤，一是病毒感染后引起宿主细胞的功能紊乱或者病毒大量复制导致的宿主细胞直接死亡。二是溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，通过增强肿瘤抗原呈递、引起肿瘤细胞免疫源性死亡、释放多种细胞因子及趋化因子等多种机制增强局部乃至全身的抗肿瘤免疫反应，产生更加持久和广泛的抗肿瘤效果。随着近年来肿瘤免疫治疗的兴起，后一种机制被认为更加重要，特别是联合其它的抗肿瘤免疫治疗策略如CART细胞治疗，可以大大增强对实体肿瘤的治疗效果。
[0003]另一方面，溶瘤病毒通过改造，自身可以作为复制性病毒载体，携带外源效应基因在肿瘤局部特异性的高表达，也可以进一步增强溶瘤病毒的治疗效果。目前溶瘤病毒携带的外源分子主要包括以下几类：诱导细胞死亡相关分子，抗血管生成分子，免疫调节因子等。免疫调节因子是目前最主要的外源效应分子，如GM
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CSF，CCL5等。如已经被FDA批准上市的T
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VEC即是利用重组HSV溶瘤病毒表达免疫调节细胞因子GM
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CSF，增强溶瘤病毒的效果。
[0004]新城疫病毒(NDV)是一种天然的溶瘤病毒，为单股负链RNA病毒，其天然宿主为禽类，对人体无致病性。NDV用于肿瘤治疗的研究历史超过50年，研究结果表明NDV应用于人体具有良好的安全性，在体内体外均可以选择性的杀伤多种人肿瘤细胞，实现一定的治疗效果，但是单纯依靠天然NDV的溶瘤作用还不足以产生足够的治疗效果，因此还需要对其进行改造，通过携带表达不同的效应基因以及开展与其它治疗方法的联合应用提高疗效。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒及其应用，解决了解决目前肿瘤治疗，特别是实体肿瘤免疫治疗中，肿瘤免疫抑制性微环境导致免疫治疗效果不佳的问题。
[0006]本专利技术提供了一种表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒，通过将人GM
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CSF基因插入新城疫病毒Italien株基因组质粒中，经体外病毒复活获得，所述的人GM
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CSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术还提供了上述表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒的构建方法，具体包括如下步骤：
[0008]S1，在CDS区上下游分别添加NDV转录调控序列GS和GE，在片段两端添加BsiWI酶切位点，然后经BsiWI酶切连接至基因组质粒pBR
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rNDV位点，获得质粒pBR
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rNDV
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hGMCSF，转入工程菌中；
[0009]所述GS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0010]所述GE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0011]S2，BSR
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T7/5经消化后转移至新的容器中，加入DMEM培养基培养，采用PEI转染试剂进行转染，转染完成后观察细胞生长状态，待出现细胞融合现象后表明病毒复活成功，重组病毒命名为rNDV
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hGMCSF。
[0012]进一步地，S2中，所述DMEM培养基含体积分数10％胎牛血清和100μg/mL青链霉素。
[0013]进一步地，S2中，PEI转染试剂的浓度为1mg/mL。
[0014]进一步地，S2中，转染过程中，按照质粒的质量比pBR
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rNDV
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hGMCSF：pCI
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NP：pCI
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P：pCI
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L＝2:1:1:1混合。
[0015]本专利技术还提供了所述的表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒在制备肿瘤治疗药物中的应用。
[0016]进一步地，所述的表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒能够单独用于制备肿瘤治疗药物。
[0017]进一步地，所述的表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒能够联合其它治疗药物用于制备肿瘤治疗药物。
[0018]进一步地，其它治疗药物包括但不限于肿瘤的外科手术治疗药物、放射线治疗药物、化学治疗药物、抗体治疗药物、免疫细胞治疗药物、介入治疗药物、干细胞治疗药物。
[0019]与现有技术相比，本专利技术提供的一种表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒及其应用，具有以下有益效果：
[0020]1、本专利技术基于新城疫病毒Italien株，该毒株是新城疫病毒的强毒株和溶瘤毒株。
[0021]2、本专利技术构建的重组溶瘤新城疫病毒表达人GM
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CSF分子，该分子是人体重要的淋巴细胞趋化因子，招募单核细胞来源的DC、激活中性粒细胞等、促进DC分化成熟和促进抗原加工和呈递方面具有重要的作用。GM
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CSF也是目前最常见的应用于溶瘤病毒基因改造的外源效应基因。
[0022]3、本专利技术以溶瘤新城疫病毒Italien株为基础构建携带外源基因的溶瘤病毒载体，具有以下的特点：
[0023]a.新城疫病毒Italien株为强毒株和溶瘤毒株。新城疫病毒的成熟(即病毒具有感染活性)需要水解病毒F蛋白，相较于目前常用的中弱毒株，Italien株F蛋白可以被更多种蛋白酶水解，因此新城疫病毒Italien株具有更加广泛的体内分布潜力和感染更多肿瘤类型的潜力。
[0024]b.相较于复制缺陷型病毒载体，溶瘤病毒载体可以在肿瘤细胞中特异性复制。一方面病毒直接杀伤肿瘤细胞，激活局部的炎症反应，提高抗肿瘤免疫反应水平；另一方面在局部表达外源基因产物，提高局部产物浓度的同时避免全身应用出现的不良反应，具有更好的安全性。
[0025]c.新城疫病毒为RNA病毒，复制和转录过程不进入细胞核，不具有基因整合的风险；其天然宿主为禽类，应用于人体具有较好的安全性。
附图说明
[0026]图1为本专利技术中重组溶瘤新城疫病毒基因组结构示意图；
[0027]图2为本专利技术重组溶瘤新城疫病毒体外对多种肿瘤细胞选择性杀伤检测图；
[0028]其中，图A表示重组溶瘤新城疫病毒对肺癌细胞系A549活率的影响；
[0029]图B表示重组溶瘤新城疫病毒对肺癌细胞系NCI
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H460活率的影响；
[0030]图C表示重组溶瘤新城疫病毒对肺癌细胞系NCI
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H1299活率的影响；
[0031]图D表示重组溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒，其特征在于，所述表达GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒为向新城疫病毒溶瘤毒株Italien株的基因组中插入人GM
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CSF的全长基因后获得，所述GM
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CSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种权利要求1所述的表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1，在CDS区上下游分别添加NDV转录调控序列GS和GE，在片段两端添加BsiWI酶切位点，然后经BsiWI酶切连接至基因组质粒pBR
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rNDV位点，获得质粒pBR
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rNDV
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hGMCSF，转入工程菌中；所述GS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述GE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；S2，BSR
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T7/5经消化后转移至新的容器中，加入DMEM培养基培养，采用PEI转染试剂进行转染，转染完成后观察细胞生长状态，待出现细胞融合现象后表明病毒复活成功，重组病毒命名为rNDV
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hGMCSF。3.如权利要求2所述的表达人GM
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CSF的重组溶瘤新城疫病毒的构建方法，其特征在于，S2中，所述DMEM培养基含体积分数10％胎牛血清和100μg/mL青链霉素。4.如权利要求2所述的表达人GM

【专利技术属性】
技术研发人员：边惠洁，陈志南，尉丁，刘满，张仁宇，孔令敏，南刚，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：