【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，特别是涉及prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr引物探针组合、试剂盒及应用。
技术介绍
1、猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome,prrs)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)引起的以母猪流产和仔猪呼吸道症状为主要特征的急性传染病。2015年之前，prrsv归属为动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，包含两个基因型，分别是欧洲型prrsv和美洲型prrsv。由于动脉炎病毒科中大量未被明确定义分类的鼠病毒的出现，prrsv的分类地位也发生了变化。briton等人使用fasttree 2.1.4sse3 ml phylogeny对套式病毒目5个保守域3clpro、niran、rdrp、zbd和hel1进行多序列比对分析(msa)，引入亚科、亚属等新的分类等级。依据该分类标准，prrsv的两个基因型prrsv-1和prrsv-2被归类于动脉炎病毒科，β-动脉炎病毒属(betaarterivirus)的两个不同亚属，即eurpobartevirus和ampobartevirus，并更改病毒种级命名为betaarterivirussuid 1(prrsv-1)和betaarterivirus suid 2(prrsv-2)。
2、我国存在的prrsv种类主要有subtypeⅰ(global)、lineage1、lineage3、lineage5、lineage8prrsv、类nadc34 prrsv和类hp
3、目前用于prrsv检测的方法主要包含抗体检测和抗原检测，而抗原检测包含病毒分离和检测prrsv的蛋白或核酸，用于prrsv蛋白检测的方法包含胶体金法、间接免疫荧光、夹心elisa等，以上方法均存在敏感性不足的问题，用于prrsv核酸检测的方法包含普通rt-pcr方法、荧光pcr方法和荧光rt-pcr方法等。目前荧光rt-pcr方法应用最广，然而，我国当前应用的荧光rt-pcr方法存在prrsv-1和prrsv-2无法区分、针对各个基因型prrsv的检测特异性低等缺点。因此，建立一种prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr方法及其试剂盒对我国prrsv的检测与诊断意义重大。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr引物探针组合、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用该引物探针组合构建的双重荧光一步rt-pcr检测方法，可以通过一步实现对不同亚型的prrsv-1毒株和prrsv-2毒株全覆盖区分检测，具有重要的实际应用价值。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括prrsv-1引物探针组和prrsv-2引物探针组；
4、其中，所述prrsv-1引物探针组为：
5、prrsv-1-f1(seq id no:1)：5’-ggaaggacctcccgagtatttc-3’；
6、prrsv-1-r1(seq id no:2)：5’-gagggatgccgacagggact-3’；
7、prrsv-1-pro(seq id no:3)：5’-ttgcacacggtgtctc-3’；
8、所述prrsv-2引物探针组为：
9、prrsv-2-f2(seq id no:4)：5’-ytrcatgtgagcgacaaacctttcc-3’；
10、prrsv-2-r2(seq id no:5)：5’-cggcgycacgaccaatgtcatag-3’；
11、prrsv-2-pro(seq id no:6)：5’-ccgctcccgcagagrccyaarcctga-3’；
12、上述序列中y为c或t，r为a或g。
13、优选的是，所述prrsv-1-pro的5’端标记荧光报告基团fam，3’端标记荧光淬灭基团mgb；
14、所述prrsv-2-pro的5’端标记荧光报告基团vic，3’端标记荧光淬灭基团为bhq1。
15、本专利技术还提供一种prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr检测试剂盒，包括所述的引物探针组合。
16、优选的是，所述检测试剂盒还包括mix反应液、标准阴性质控品和标准阳性质控品。
17、本专利技术还提供一种非诊断目的鉴别prrsv-1和prrsv-2的双重荧光一步rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
18、以待测样品的rna为模板，利用权利要求1或2所述的引物探针组合进行双重荧光一步rt-pcr扩增，对扩增结果进行判读。
19、优选的是，在所述双重荧光一步rt-pcr扩增的反应体系中，prrsv-1-f1、prrsv-1-r1和prrsv-1-pro的体积比为1:1:2；prrsv-2-f1、prrsv-2-r1和prrsv-2-pro的体积比为1:1:2。
20、优选的是，所述双重荧光一步rt-pcr扩增的反应程序为：50℃、5分钟；95℃、10秒钟；95℃、5秒钟，59℃、30秒，按此反应条件做40个循环。
21、优选的是，所述判读的标准为：当fam通道样品的扩增结果有典型的s型扩增曲线且ct值≤37时，判定为prrsv-1核酸阳性，无ct值或37<ct值≤40时判定为prrsv-1核酸阴性；当vic通道样品的扩增结果有典型的s型扩增曲线且ct值≤37时判定为prrsv-2核酸阳性，无ct值或37<ct值≤40时判定为prrsv-2核酸阴性。
22、本专利技术还提供了所述的引物探针组合在制备prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr检测试剂盒中的应用。
23、本专利技术公开了以下技术效果：
24、本专利技术提供了一种特异性检测prrsv-1和prrsv-2的引物探针组合，以及组装成一种包括该引物探针组合的prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr试剂盒。利用该引物探针组合构建的prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr试剂盒以及检测方法可以快速区分prrsv-1和prrsv-2感染的特征，具有特异性好、灵敏度高的特点，并且可以一步完成，方便且易操作，本专利技术可用于检测不同基因型的猪繁殖与呼吸综合征病毒，为猪繁殖与呼吸综合征病毒检测与防控提供科学依据。
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1.一种PRRSV-1和PRRSV-2双重荧光一步RT-PCR检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括PRRSV-1引物探针组和PRRSV-2引物探针组；
2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述PRRSV-1-pro的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团MGB；
3.一种PRRSV-1和PRRSV-2双重荧光一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括Mix反应液、标准阴性质控品和标准阳性质控品。
5.一种非诊断目的鉴别PRRSV-1和PRRSV-2的双重荧光一步RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在所述双重荧光一步RT-PCR扩增的反应体系中，PRRSV-1-F1、PRRSV-1-R1和PRRSV-1-pro的体积比为1:1:2；PRRSV-2-F1、PRRSV-2-R1和PRRSV-2-pro的体积比为1:1:2。
...【技术特征摘要】
1.一种prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括prrsv-1引物探针组和prrsv-2引物探针组；
2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述prrsv-1-pro的5’端标记荧光报告基团fam，3’端标记荧光淬灭基团mgb；
3.一种prrsv-1和prrsv-2双重荧光一步rt-pcr检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括mix反应液、标准阴性质控品和标准阳性质控品。
5.一种非诊断目的鉴别prrsv-1和prrsv-2的双重荧光一步rt-pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在所述双重荧光一步rt-pcr扩增的反应体系中，prrsv-1-f1、prrsv-1-r1...
【专利技术属性】
技术研发人员：张洪亮，田志军，徐姗姗，王倩，彭金美，周国辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：
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