【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于分子生物学检测技术，特别是关于一种用于检测upec毒力基因的引物和探针、试剂和试剂盒。
技术介绍
1、大肠杆菌(escherichia coli，ec)属于肠道杆菌中的一种，一旦人体机能发生变化，免疫力低下或打破肠道该有的微生物平衡，大肠杆菌就会大量繁殖，释放毒素导致人体患病，甚至移居到肠道以外的地方，包括泌尿系统如尿道、膀胱、输尿管、肾脏等，以及胆囊、阑尾等，造成相应部位的感染或全身播散性感染。其中尿路感染(urinary tractinfection，uti)可能局限于膀胱(膀胱炎)，有轻微的局部症状，也可以延伸到肾脏(肾盂肾炎)，症状更严重，可发展成危及生命的败血症、尿毒症。传统上认为uti是女性的一种疾病，其中2％的女性在其一生中都会受到影响。约6％的细菌性膀胱炎首发女性在6个月内复发性uti，部分患者在初次发作后一年内有2次或更多次感染。
2、95％以上的尿路感染是由单一细菌引起的，而大肠杆菌是引发尿路感染的主要致病菌，其占比超过80％，称为尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic escherichia coli，upec)。upec菌株在流行病学和系统发育上与胃肠道中的共生大肠杆菌不同，编码多种毒力因子，在细菌定植、发病机制和尿路持久性中发挥重要作用。根据表达的毒力因子，upec引起症状性尿路感染的能力将受到影响。大肠杆菌的主要毒力因子与细菌细胞表面有关，或者分泌并输出到其作用部位。upec感染的主要一个通路是在胃肠道菌群定植于尿道周围区域后引入或者外源性引入，通过一种不明机制进入
3、尿路感染病原体的诊断金标准为尿液细菌培养鉴定及药敏分析，但培养法的周期较长，通常要3～5天时间且漏检率高，灵敏度较低。鉴于时长，诊治主要依据临床症状评估结合当地细菌耐药性监测数据，先给抗菌药经验性治疗，待获知病原学检测及药敏试验结果后，再进行调整。这种经验推测性治疗方案一定程度上导致了抗生素的不合理使用，导致了细菌变异事态愈发严峻，继而使得耐药菌大幅增加和散播。一项小鼠研究显示，环丙沙星亚治疗水平可增加小鼠泌尿路感染。因此很有必要开发新的可替代的技术做一个迭代，精准靶向，精准用药。
4、而且，临床上鉴别尿路感染只能根据放射学检查进行鉴别，可大致分为累及肾脏的尿路感染(肾盂肾炎)和局限于膀胱的尿路感染(膀胱炎)，但是放射学检查因使人暴露于一定剂量的辐射下，长期会增加患癌的风险、对孕妇和儿童敏感性较高而不适用、器械或患者体内物质的干扰造成误诊以及费用较高，部分患者难以承担等存在的弊端使得该方法难以大型推广。
5、针对病原性大肠杆菌检测，已有不少科研工作者做出了一些成绩，例如中国专利cn 115725689 a公开了一种基于高灵敏gmr磁生物芯片的大肠杆菌检测方法，主要包括以下几个步骤：s1 gmr生物芯片的准备；s2捕获大肠杆菌；s3 gmr生物芯片的测试，大肠杆菌信息的读出。该技术除了并未将致病性的大肠杆菌和共生性的大肠杆菌进行区分，而且同样有着成本高，操作繁琐，对人员要求高等问题。多重pcr作为一种成熟的通用技术，已广泛应用于病原体鉴定、基因分型、定量遗传病诊断等领域，比如中国专利cn116949224b借助多重pcr检测猫消化道病原体，扩增效果准确，灵敏度和重复性高；中国专利cn 116555486 b提供了一种多重pcr用于检测14种高危型人乳头状瘤病毒e6/e7区mrna的试剂盒，具有检测特异性好、灵敏度高，检测结果准确的优点；中国专利cn 106367481 b提供了一种扩增brca1/2基因的多重pcr引物及一种多重pcr引物的设计方法，实现高度自动化、高通量的遗传性乳腺癌brca1/2基因检测。通过多方调研发现目前尚未有基于尿路感染，开发多重qpcr检测upec的多种致病性毒力因子的方法，为膀胱炎的诊断提供一个参考。因此，亟需一款快速、准确、便捷、操作简单、成本低廉的upec毒力基因检测产品，检测项目应可覆盖引起膀胱炎的uepc的毒力基因，可在疾病早期指导精准用药，解决临床诊疗痛点。
6、公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于检测upec毒力基因的引物和探针、试剂和试剂盒，其产品的引物/探针之间无交叉污染或干扰。并且本专利技术方案基于多色荧光通道，可实现“一管式pcr”技术(taqman探针)同时对多个靶标进行定性检测，能够覆盖引起膀胱炎的uepc的毒力基因，可在疾病早期指导精准用药，解决临床诊疗痛点，具有重要的临床意义。
2、为实现上述目的，本专利技术的实施例提供了用于检测upec毒力基因的引物和探针，至少包括如下任一的序列：用于检测upec毒力基因fimh的引物和/或探针，其引物序列如seq id no.1～2中至少任一所示、其探针序列如seq id no.3所示；用于检测upec毒力基因papg ii的引物和/或探针，其引物序列如seq id no.4～5中至少任一所示、其探针序列如seq id no.6所示；用于检测upec毒力基因papg iii的引物和/或探针，其引物序列如seqid no.7～8中至少任一所示、其探针序列如seq id no.9所示；用于检测upec毒力基因afa的引物和/或探针，其引物序列如seq id no.10～11中至少任一所示、其探针序列如seq idno.12所示。即针对性地检测有利于引发膀胱炎的upec毒力基因为i型菌毛粘附亚基fimh、papg ii和/或papg iii粘附素的p-菌毛以及afa粘附素。
3、在本专利技术的一个或多个实施方式中，还包括针对内参基因β-actin的引物探针，至少包括如下任一：其引物序列如seq id no.13～14所示、其探针序列如seq id no.15所示。优选地，作为一种优化的组合方案，进一步限定的引物探针组中fimh、papg ii、papg iii、afa以及β-actin的引物/探针体积比为4：4：3：5：4。
4、在本专利技术的一个或多个实施方式中，探针的5’端还标记有荧光基团。荧光基团选自：fam、vic、rox、cy5和cy5.5等常规荧光基团，它们的检测波长互不相同，可用于合成有标记的探针。优本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测UPEC毒力基因的引物和探针，至少包括如下任一的序列：
2.如权利要求1所述的用于检测UPEC毒力基因的引物和探针，其特征在于，还包括针对内参基因β-actin的引物和/或探针，至少包括如下任一：其引物序列如SEQ ID NO.13～14所示、其探针序列如SEQ ID NO.15所示。
3.如权利要求1或2所述的用于检测UPEC毒力基因的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端还标记有荧光基团。
4.如权利要求1或2所述的用于检测UPEC毒力基因的引物和探针，其特征在于，所述探针的3’端还标记有淬灭基团。
5.荧光定量PCR检测试剂，至少包括如权利要求1-4任一所述的用于检测UPEC毒力基因的引物和探针。
6.如权利要求5所述的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，检测试剂还包括适量的核酸DNA和扩增缓冲液、dNTP、dUTP、MgCl2、Taq聚合酶、UNG酶和ddH2O。
7.如权利要求6所述的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的组成包括，以体积为50μL计：1.0mmol/L
8.如权利要求7所述的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的组成包括，以体积为50μL计：2.5mmol/L的MgCl2，0.2mmol/L的dNTP，引物和探针fimH、PapG II、PapGIII、afa以及β-actin的加量分别是0.5μL、0.5μL、0.375μL、0.625μL和0.5μL，2.0U的Taq聚合酶，0.2U的UNG酶，0.2mmol/L的dUTP，25μL的2×扩增缓冲液，以及10μL的模板DNA，余量为ddH2O。
9.如权利要求8所述的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中用于检测fimH基因的引物和探针、用于检测PapG II基因的引物和探针、用于检测PapG III基因的引物和探针、用于检测afa基因的引物和探针以及用于检测β-actin基因的引物和探针，每一个基因的两对引物和一条探针的摩尔浓度比均满足：2：2：1。
10.如权利要求8所述的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的PCR反应的程序为：
11.试剂盒，包括如权利要求1-4任一所述的用于检测UPEC毒力基因的引物和探针或如权利要求5-10任一所述的荧光定量PCR检测试剂。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测upec毒力基因的引物和探针，至少包括如下任一的序列：
2.如权利要求1所述的用于检测upec毒力基因的引物和探针，其特征在于，还包括针对内参基因β-actin的引物和/或探针，至少包括如下任一：其引物序列如seq id no.13～14所示、其探针序列如seq id no.15所示。
3.如权利要求1或2所述的用于检测upec毒力基因的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端还标记有荧光基团。
4.如权利要求1或2所述的用于检测upec毒力基因的引物和探针，其特征在于，所述探针的3’端还标记有淬灭基团。
5.荧光定量pcr检测试剂，至少包括如权利要求1-4任一所述的用于检测upec毒力基因的引物和探针。
6.如权利要求5所述的荧光定量pcr检测试剂，其特征在于，检测试剂还包括适量的核酸dna和扩增缓冲液、dntp、dutp、mgcl2、taq聚合酶、ung酶和ddh2o。
7.如权利要求6所述的荧光定量pcr检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的组成包括，以体积为50μl计：1.0mmol/l-4.5mmol/l的mgcl2，0.1mmol/l-0.4mmol/l的dntp，如权利要求1-4任一所述的引物和探针中满足每条引物浓度为0.1-1μm和每条探针浓度为0.1-0.5μm，0.5u-2.5u的taq聚合酶，...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜婷，后来旺，苏波，郭丹，孙德伟，刘松林，吴淳嘉，郭兴中，
申请(专利权)人：江苏绿叶诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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