【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外诊断基因检测，具体涉及一种检测人类pdgfra基因d842v突变的引物探针组合、试剂盒及方法。
技术介绍
1、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,gist)是消化道最常见的间叶源性肿瘤，占胃肠道恶性肿瘤的1％～3％，估计年发病率约为10～20/100万，多发于中老年患者，40岁以下患者少见，男女发病率无显著差异。研究表明gist对常规放疗、化疗均高度耐受，预后较差，5年生存率低于35％，且易复发和转移。gist大部分发生于胃(50％～70％)和小肠(20％～30％)，结直肠约占10％～20％，食道约占0％～6％，肠系膜、网膜及腹腔后罕见。gist病人20％～30％是恶性的，第一次就诊时约有11％～47％已有转移，转移主要在肝和腹腔。根据目前基因检测序列分析，gist基因突变类型主要分为三种：c-kit基因突变型、pdgfra基因突变型和c-kit/pdgfra野生型。此外，大量研究已表明c-kit基因及pdgfra基因功能增强性突变是绝大多数gist发生的两个主要发病机制。
2、pdgfra基因编码的蛋白全名为血小板源性生长子受体α，是一种细胞表面受体酪氨酸激酶。pdgfra癌基因位于人类染色体4q12-13，由23个外显子组成。其信息传输路径与c-kit相似，pdgfra可在多个位点发生多种突变，以外显子18突变最为常见(约占整个pdgfra基因突变的90％)，其次为外显子12、14。pdgfra基因外显子18突变类型以d842v的点突变最多见，且pdgfr
3、目前检测基因突变的方法主要有测序法、熔解曲线法和荧光pcr法等。如专利申请cn110938696a(名称为一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒)采用测序法检测c-kit和pdgfra基因是否突变，加入了锁核酸探针提高了突变的检出率，但是检测步骤复杂且周期较长；专利技术专利cn105463112b(名称为用于检测人类pdgfra基因d842v突变的引物、探针及试剂盒)采用amrs引物特异性结合突变位点，经过设计和优化后检测能力为1％，但灵敏度仍然无法达到在血浆/血清样本中检测pdgfra d842v的水平。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术旨在开发一种检测人类pdgfra基因18号外显子d842v突变的试剂和方法，该方法不仅操作简单，而且灵敏度可达3‰水平，利于推广应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
3、本专利技术第一方面提供了一种检测人类pdgfra基因d842v突变的引物探针组合，其包括用于检测人类pdgfra基因d842v突变位点的探针和引物，所述探针和引物的核苷酸序列具体如下所示：
4、f1：gagattggcctggccaaagt(seq id no.1)；
5、r1：aaagtgaaggaggatgagcctga(seq id no.2)；
6、p1：tgtcgaaaggcagtgtac(seq id no.5)。
7、在上述引物探针组合中，pdgfra基因18号外显子d842v突变位点的特异性上游arms引物(即seq id no.1)，与d842v位点突变序列特异性结合；seq id no.2所示引物为d842v位点突变下游引物，与pdgfra基因的保守序列结合；seq id no.5所示探针为d842v位点突变的探针，能与扩增片段结合。
8、本专利技术所述的pdgfra基因18号外显子d842v是1个难于设计引物和探针的位点，专利技术人在前期研究中发现，根据现有技术教导，对上游arms引物，从3’端第二个碱基开始进行错配(可以是一个碱基、两个碱基或两个以上的组合错配)，或在5’端增加尾巴，都可以提高检测体系的特异性，但是均不能有效提高灵敏度。专利技术人通过大量对比试验，欣喜的发现，在上游arms引物的3’端第四个碱基处进行碱基错配的同时，在5’端第三和第四个碱基进行错配后，不仅能显著提高体系的特异性，而且有效提高了体系的灵敏度。
9、优选地，在上述引物探针组合中，还包括用于检测外控基因的探针和引物，所述探针和引物的核苷酸序列具体如下所示：
10、f2：tgggagtggactgctggtg(seq id no.3)；
11、r2：gacttgccctgcacctccta(seq id no.4)；
12、p2：ggagacatggatctgaact(seq id no.6)；
13、在上述引物探针组合中，seq id no.3所示引物为特异性上游arms引物，与pdgfra基因保守序列特异性结合，选择性的扩增目标序列；seq id no.4所示引物为下游引物，与pdgfra基因保守序列结合；seq id no.6所示探针为外控基因的探针，能与扩增片段结合。
14、在本专利技术所述的引物探针组合中，探针p1、p2的5’端分别修饰有荧光报告基团且3’端修饰有荧光淬灭基团，其中，荧光报告基团选自fam、vic、hex、ned、texas red、cy3、cy5，荧光淬灭基团选自tamara、bhq1、bhq2、mgb。
15、在本专利技术的一个具体实施例中，探针p1的5’端修饰有fam，3’端修饰有mgb；探针p2的5’端修饰有vic，3’端修饰有mgb。mgb(minorgroovebinder)基团可与dna螺旋小沟结合，进而提高mgb探针与对应模板的杂交稳定性；相对于普通taqman探针，mgb探针序列可设计得更短，特异性更强。
16、本专利技术第二方面提供了一种检测人类pdgfra基因d842v突变的试剂盒，除包括本专利技术所述的引物探针组合外，还包括酶混合液、阳性对照、阴性对照和pcr缓冲液等本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物探针组合，其特征在于，包括用于检测人类PDGFRA基因D842V突变位点的探针和引物，其中所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括用于检测外控基因的探针和引物，其中所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰有荧光报告基团且3’端修饰有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、NED、Texas red、CY3、CY5；所述荧光淬灭基团选自TAMARA、BHQ1、BHQ2、MGB。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光淬灭基团为MGB。
5.如权利要求1～4任一项所述的引物探针组合在制备检测人类PDGFRA基因突变的产品中的应用。
6.一种检测人
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶混合液、阳性对照、阴性对照和PCR缓冲液；所述酶混合液中包括Taq酶和UNG酶；所述阳性对照包含两种质粒，所述两种质粒分别含有PDGFRA基因D842V突变基因和外控基因；所述阴性对照为Tris-HCl缓冲液或ddH2O；所述PCR缓冲液包括MgCl2，dATP、dUTP、dCTP、dGTP和参比染料ROX。
8.一种检测人类PDGFRA基因D842V突变的方法，其特征在于，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，所述方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，在所述PCR扩增反应中，所述探针或所述引物的工作浓度为50-600nmoL/L。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括福尔马林固定石蜡包埋的胃肠道间质瘤组织样本和血液。
...【技术特征摘要】
1.一种检测人类pdgfra基因d842v突变的引物探针组合，其特征在于，包括用于检测人类pdgfra基因d842v突变位点的探针和引物，其中所述引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示，所述探针的核苷酸序列seq id no.5所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括用于检测外控基因的探针和引物，其中所述引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.6所示。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰有荧光报告基团且3’端修饰有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团选自fam、vic、hex、ned、texas red、cy3、cy5；所述荧光淬灭基团选自tamara、bhq1、bhq2、mgb。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光淬灭基团为mgb。
5.如权利要求1～4任一项所述的引物探针组合在制备检测人类pd...
【专利技术属性】
技术研发人员：李玉，董瑞华，李文萍，曾超，魏亮，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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