【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外诊断基因检测，具体涉及一种检测人类ugt1a1基因多态性的核酸组合、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、伊立替康是治疗结直肠癌的主要药物，它是sn-38的前体药。sn-38通过抑制拓扑异构酶i的活性，从而抑制dna复制和转录，产生细胞毒作用。尿苷二磷酸糖醛基转移酶1a1(ugt1a1)是sn-38代谢的关键酶，ugt1a1可将sn-38转化为糖基化的sn-38(sn-38g)，sn-38的代谢速率和ugt1a1基因遗传多态性有关。野生型ugt1a1(*1/*1)在第71位密码子处存在多态性(g71r，导致酶活性降为野生型的30％～49％，其多态性频率在东亚人群中约为13％)，当该位点出现ga杂合基因型时(*1/*6)，患者对伊立替康药物毒副作用的抵抗能力降低；当该位点出现aa纯合基因型时(*6/*6)，更易发生不良反应，应予以降低伊立替康的使用剂量。野生型ugtia1(*1/*1)的tata盒有6个重复的ta，当该位置出现(ta)6/(ta)7杂合基因型时(*1/*28)，患者按正常剂量服用伊立替康，产生3级腹泻可能性显著增高；当该位置出现(ta)7/(ta)7纯合基因型时(*28/*28)，患者更易发生不良反应，应予以降低伊立替康的使用剂量。
2、在目前的临床应用之中，dna直接测序法作为基因检测的金标准方法，具有灵敏度高、结果判读较准确的优点，但由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，难以实现大规模推广。荧光pcr探针法操作相对简单，检测周期短，临床应用较为广泛，但根据(ta)
3、荧光pcr熔解曲线法操作相对简单，但由于(ta)7和(ta)6的探针tm值差异较小，易于产生非特异峰，结果判读比较困难。如专利cn116287147a使用荧光pcr熔解曲线法，但从结果附图中可以看到，该专利申请中设计的*28位点探针出现了主峰之外杂峰(非特异性熔解峰)，说明该专利申请设计也无法完全区分*28位点的杂合和纯合状态，而临床应用需要明确和完全地区分*28位点的杂合和纯合状态。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术旨在提供一种基于荧光pcr熔解曲线法检测人ugt1a1基因*28位点的核酸组合、试剂盒和方法，以实现人ugt1a1基因*28位点的基因型的直观、准确地区分。
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
3、本专利技术第一方面提供了一种检测人类ugt1a1基因多态性的核酸组合，包括用于检测人ugt1a1基因*28位点的引物和探针，引物的核苷酸序列如seq id no.1-2所示，探针的核苷酸序列如seq id no.7所示；其中，seq id no.7所示的探针序列的连续ta区域碱基进行了3～5个能够增强结合力的修饰，且所述修饰包括但不限于lna、pna等，所述连续ta区域具体为自探针5’端起第2个至第13个碱基之间的区域。
4、专利技术人通过对人ugt1a1基因*28位点的深入分析和探索实验，认为荧光pcr方法中容易产生非特异性峰进而导致判读困难的原因在于：ugt1a1基因的*28位点位于ugt1a1基因启动子区域tata盒，野生型为(ta)6，突变型为(ta)7，当(ta)6的探针与(ta)7的模板在同一个体系中时，探针和模板的相互结合过程中会产生滑动(模板上剩余的ta会凸起形成鼓泡，该鼓泡可以是第1个ta形成的，也可以是第7个ta形成的)，形成2种以上tm值差异较小的二级结构，该二级结构在荧光pcr探针法中表现为非特异性扩增曲线，在荧光pcr熔解曲线法中表现为主熔解峰旁边产生难以区分的非特异性的副熔解峰，从而导致检测结果非特异。基于上述现象，专利技术人进一步实验发现，在探针设计过程中先保持待检测位点在探针的中间位置，然后对探针的连续ta区域碱基均匀的进行增强结合力的修饰(在容易产生滑动的区域钉入楔子或钉子来防止模板和探针间产生滑动现象)，能较好的提高探针与模板结合时特异性。本专利技术改变了常规的探针设计方式，而且实验表明，本专利技术提供的探针能够取得较好的效果。
5、优选地，在上述核酸组合中，碱基修饰的位置为第3、5、7、9、11个碱基，或为第3、6、9、12个碱基，或为第4、7、10个碱基。如在本专利技术的一个具体实施例中，碱基修饰的位置和方式为：在连续ta区域的第4、7、10个碱基上进行lna修饰。
6、结合人类ugt1a1基因主要流行的突变位点，在本专利技术所述的核酸组合中，优选包括用于检测ugt1a1基因*6位点的引物和探针，其中引物的核苷酸序列如seq id no.3-4所示，探针的核苷酸序列如seq id no.8所示。
7、优选地，在本专利技术所述的核酸组合中，还可以包括用于检测内标基因的引物和探针；在本专利技术的一个具体实施例中，用于检测内标基因的引物的核苷酸序列如seq idno.5-6所示，配套探针的核苷酸序列如seq id no.9所示。
8、在本专利技术所述的核酸组合中，探针的5’端修饰有荧光基团且3’端修饰淬灭基团，其中荧光基团选自fam、vic、hex、rox、ned、texred、cy3、cy5等，淬灭基团选自tamara、bhq1、bhq2、mgb等。如在本专利技术的一个具体实施例中，seq id no.7所示的探针的5’端修饰有fam，3’端修饰有mgb；seq id no.8所示的探针的5’端修饰有vic，3’端修饰有mgb；seq id no.9所示的探针的5’端修饰有rox，3’端修饰有mgb。
9、本专利技术第二方面提供了一种检测人类ugt1a1基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括用于检测ugt1a1基因*28和/或*6位点的核酸组合。
10、优选地，在上述试剂盒中，还包括酶混合液、阳性对照、阴性对照和pcr缓冲液。更为优选地，所述酶混合液包括taq酶和ung酶；所述阳性对照包括两种质粒，所述两种质粒分别含有ugt1a1基因*28、*6的野生型基因；所述阴性对照为tris-hcl或ddh2o；所述pcr缓冲液包括mgcl2，datp、dutp、dctp和dgtp。
11、本专利技术第三方面提供了一种检测人类ugt1a1基因多态性的pcr反应体系，该反应体系包括用于检测ugt1a1基因*28、*6位点以及内标基因的核酸组合，即包含序列如seq idno.1-9所示的引物或探针。
12、将不同基因位点的荧光定量pcr引物探针组合到同一个pcr反应体系中需要考虑不同引物探针间的干扰，以避免非特异性扩增，而本专利技术提供的上述核酸组合可以避免引物探针间干扰进而避免非特异性扩增，即本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测人类UGT1A1基因多态性的核酸组合，其特征在于，包括用于检测UGT1A1基因*28位点的引物和探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，且SEQ ID NO.7所示序列的5’端第2至13个碱基区域中含有3-5个LNA和/或PNA修饰。
2.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述修饰的位置为第3、5、7、9、11个碱基，或第3、6、9、12个碱基，或第4、7、10个碱基。
3.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，还包括：
4.一种检测人类UGT1A1基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的核酸组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶混合液、阳性对照、阴性对照和PCR反应液；所述酶混合液包括Taq酶和UNG酶；所述阳性对照包括两种质粒，所述两种质粒分别含有UGT1A1基因*28、*6的野生型基因；所述阴性对照为Tris-HCl或ddH2O；所述PCR缓冲液包括MgCl2，dATP、dUTP、dCTP
6.一种检测人类UGT1A1基因多态性的PCR反应体系，其特征在于，包括权利要求3所述的核酸组合。
7.根据权利要求6所述的PCR反应体系，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.3、SEQ ID NO.5所示的引物的工作浓度为50-100nmol/L，核苷酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示的引物或探针的工作浓度为100-600nmol/L。
8.如权利要求1-3任一项所述的核酸组合或如权利要求5-6任一项所述的试剂盒或如权利要求7-8任一项所述的PCR反应体系在检测人类UGT1A1基因*28位点和/或*6位点的基因型中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，S1所述人类基因组DNA来自人血液、血斑、唾液、唾液斑、羊水中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种检测人类ugt1a1基因多态性的核酸组合，其特征在于，包括用于检测ugt1a1基因*28位点的引物和探针，所述引物的核苷酸序列如seq id no.1-2所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.7所示，且seq id no.7所示序列的5’端第2至13个碱基区域中含有3-5个lna和/或pna修饰。
2.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述修饰的位置为第3、5、7、9、11个碱基，或第3、6、9、12个碱基，或第4、7、10个碱基。
3.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，还包括：
4.一种检测人类ugt1a1基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的核酸组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶混合液、阳性对照、阴性对照和pcr反应液；所述酶混合液包括taq酶和ung酶；所述阳性对照包括两种质粒，所述两种质粒分别含有ugt1a1基因*28、*6的野生型基因；所述阴性对照为tris-hcl或ddh2o；所述pcr缓冲液包括mgcl2...
【专利技术属性】
技术研发人员：文行正，李子瑞，董瑞华，曾超，魏亮，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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