鸡传染性支气管炎KC疫苗毒株及其制备方法、疫苗技术

本发明专利技术公开了一种鸡传染性支气管炎KC疫苗毒株及其制备方法、疫苗，涉及生物工程技术领域。具体的，本发明专利技术基于特定的引物，以Beaudette

【技术实现步骤摘要】
鸡传染性支气管炎KC疫苗毒株及其制备方法、疫苗


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎KC疫苗毒株及其制备方法、疫苗。

技术介绍

[0002]鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis，IBV)感染引起的一种严重危害家禽养殖业的高传染性疾病。IBV属于γ
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冠状病毒，IBV和其他冠状病毒一样，具有高突变性和重组能力，导致抗原置换和漂移，继而产生变种。迄今为止，IBV已有30多种血清型，但不同血清型之间交叉保护性差，使该病近年来的流行呈上升趋势。传统单价疫苗H120、H52、W93和二联苗La Sota/HB1+H120，LaSota/B1+H52的使用虽然能有效抑制同源毒株但不能对异源毒株产生有效的交叉抑制。疫苗免疫的压力促进了主流毒株的突变，进而导致新毒株的崛起，旧的免疫方式失效。因而研发快速应对新的突变株的新型疫苗迫在眉睫。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株，其可有效区分受检动物所携带的病毒是来自于疫苗接种还是自然感染，为IBV标记疫苗提供标记位点参考。
[0004]本专利技术还要解决的技术问题在于，提供一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的制备方法。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题在于，提供一种鸡传染性支气管炎标记疫苗。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于扩增鸡传染性病毒KC流行毒株中S1序列的引物对，包括第一引物和第二引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示
[0007]作为上述技术方案的改进，还包括第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物和第十引物；
[0008]其中，第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，第五引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，第六引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，第七引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，第八引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，第九引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，第十引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
[0009]相应的，本专利技术还公开了重组质粒，其特征在于，其由如上述的引物对扩增而得。
[0010]相应的，本专利技术还公开了重组质粒的制备方法，其包括：
[0011](1)提取鸡传染性病毒KC流行毒株总RNA，反转录为KC
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S1 cDNA；
[0012](2)以所述KC
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S1 cDNA为模板，采用第一引物和第二引物扩增，得到第一扩增产物；
Marker为蛋白质标记，p2～p5为P2～P5代鸡胚盲传尿囊液，Mock为，Beaudette
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p65为空的对照的尿囊液。
[0032]图8是病毒滴度测试结果图，其中，Beaudette
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p65为母本毒株，rIBV
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siMutBeau
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F5为母本毒株Beaudette
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p65双基因突变毒株第5代次细胞毒，rIBV
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Beau
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KC(S1)
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p10V9为rIBV
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Beau
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KC(S1)为第10代尿囊液毒在Vero细胞上继续盲传至第9代次的细胞毒；
[0033]图9是rIBV
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Beau
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KC(S1)为第4代和第10代尿囊液毒在Vero细胞上盲传细胞病变图，其中p4V1、p4V2和p4V9分别是rIBV
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Beau
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KC(S1)为第4代尿囊液毒在Vero细胞上盲传1代、2代和9代，p10V1、p10V2和p10V9分别是rIBV
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Beau
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KC(S1)为第10代尿囊液毒在Vero细胞上盲传1代、2代和9代，CPE是细胞病变的英文缩写；
[0034]图10是Western blot检测rIBV
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Beau
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KC(S1)第10代尿囊液毒在Vero细胞上盲传至第9代的细胞毒是否具有细胞适应性，其中Beaudette
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p65为母本毒株，rIBV
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siMutBeau
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F10为母本毒株Beaudette
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p65双基因突变毒株第10代次细胞毒，rIBV
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Beau
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KC(S1)
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p10V9为rIBV
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Beau
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KC(S1)为第10代尿囊液毒在Vero细胞上继续盲传至第9代次的细胞毒。
具体实施方式
[0035]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述。
[0036]本专利技术中所涉及到的材料、仪器具体如下：
[0037](1)病毒，鸡胚和细胞
[0038]IBV分离株CK/CH/GD/KPLH
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CZQ 2018(简称KC)是由华南农业大学兽医学院陈瑞爱团队分离鉴定并保存，Beaudette毒株由华南农业大学群体微生物中心刘定祥教授赠予。SPF鸡胚购自广东温氏大华农生物药品有限公司。Vero细胞购自ATCC。
[0039](2)主要试剂、试剂盒和酶
[0040]DMEM细胞培养基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、胰酶(0.25％Trypsin
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EDTA)、青
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链霉素双抗(Penicillin
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Streptomycin Solution，100
×
)购自Gibco公司；病毒总RNA/DNA提取试剂盒购自Axygen公司；生工MightyScript第一链cDNA合成Master Mix(B639251)购自生工；Top10感受态和快速质粒小提试剂盒(DP105)购自天根生化科技(北京)有限公司；pClone007 Blunt Simple Vector Kit购自北京擎科生物技术有限公司；Phanta Max Super
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Fidelity DNA Polymerase高保真PCR酶和同源重组试剂盒MultiS One Step Cloning Kit购自盒诺唯赞生物科技有限公司；PrimeSTAR GXL，pMD
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19T克隆质粒试剂盒和TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit购自TAKARA公司；蛋白Marker本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增鸡传染性病毒KC流行毒株中S1序列的引物对，其特征在于，包括第一引物和第二引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，还包括第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物和第十引物；其中，第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，第五引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，第六引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，第七引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，第八引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，第九引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，第十引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。3.重组质粒，其特征在于，其由如权利要求1或2所述的引物对扩增而得。4.重组质粒的制备方法，其特征在于，包括：(1)提取鸡传染性病毒KC流行毒株总RNA，反转录为KC
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S1 cDNA；(2)以所述KC
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S1 cDNA为模板，采用第一引物和第二引物扩增，得到第一扩增产物；(3)以质粒载体、KC
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S1 cDNA、pIBVcDNA
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5E质粒为模板，采用第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物和第十引物扩增，得到第二扩增产物；(4)将第一扩增产物和第二扩增产物同源重组、转化，得到pBR
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322
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r5E
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KC质粒。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述质粒载体为pBR322vector(delet TcR+)。6.一种鸡传染性支气管炎KC疫苗毒株的构建方法，其特征在于，包括：(1)制备如权利要求3所述的重组质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞爱，熊挺，刘定祥，
申请(专利权)人：华农肇庆生物产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：