一种复制型mRNA疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种复制型mRNA疫苗及其制备方法，涉及疫苗技术领域。本发明专利技术制备了一种表达新型冠状病毒刺突蛋白融合前稳定三聚体蛋白的复制型mRNA疫苗，构建包含新型冠状病毒S蛋白的复制型mRNA载体质粒，并用于制备复制型mRNA，结合脂质体包裹方案制备mRNA疫苗，并应用于新型冠状病毒的免疫。该方法在冠状病毒研究和疫苗创制上具有应用价值，能够大力推进疫苗的转化应用。疫苗的转化应用。

【技术实现步骤摘要】
一种复制型mRNA疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术涉及疫苗
，具体而言涉及一种复制型mRNA疫苗，包含该mRNA合成质粒的构建，该mRNA的合成制备，该mRNA疫苗的制备方法。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)自爆发以来不断发生突变和变异，不同的变异株其传播的难易程度、相关疾病的严重程度或疫苗、治疗药物的效用等有较大差别。随着新型冠状病毒的大规模流行，以及新的病毒突变株不断出现，其中一些突变株如Delta或Omicron等具有更强的感染能力和更强免疫逃逸能力。
[0003]接种疫苗被证明是预防病毒性疾病最高效、最有力的方法。目前研发所涉及的技术平台包括核酸(DNA和RNA)、病毒样颗粒、肽、病毒载体、重组蛋白、减毒活疫苗和灭活疫苗等方法。其中，基于mRNA的新型技术平台，在抗原操作和速度潜力方面具有很大的灵活性。相比传统疫苗，mRNA疫苗作为新型疫苗的形式，具有生产工艺简单、开发速度快、无需细胞培养、成本低。相较与DNA疫苗，mRNA疫苗无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组的风险，半衰期可以通过修饰进行调整。mRNA疫苗可提供对适应性和先天免疫力的综合刺激，即原位抗原表达和危险信号传递；可以诱导“平衡”免疫反应，包括体液和细胞效应因子以及免疫记忆。mRNA疫苗分为非复制性mRNA和复制型mRNA疫苗两类，复制型mRNA不仅编码目标抗原，而且编码具有能够使细胞内RNA扩增和蛋白表达的机制。
[0004]RNA复制子是自主复制的RNA，保留了病毒复制酶基因，而结构蛋白基因缺失，由外源抗原基因取代，复制酶可控制载体RNA在胞浆中高水平复制和外源基因的高水平表达。委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)属于甲病毒属病毒，其具有复制速率快，病毒滴度高，宿主范围广等优势，是理想的疫苗载体。复制酶基因nsp1～4区是病毒编码的复制酶通过模拟病毒核酸的扩增，增加了抗原基因在细胞内的表达量，另一方面，复制形成的双链RNA通过激活模式识别受体介导的信号转导，增强了疫苗的免疫效果。基于复制子的疫苗不会产生能复制的感染性病毒粒子，不可能与细胞基因组发生整合，但可诱导全身免疫和粘膜免疫以及MHCI限制性CTL反应，而不受体内已有载体抗体的干扰。
[0005]目前已有新型冠状病毒mRNA疫苗进入临床试验与应用，但安全性和有效性还有待证明，仍有失败的风险。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术构建了基于VEE复制子系统的复制型新型冠状病毒mRNA疫苗，研究发出一种表达新型冠状病毒蛋白的复制型mRNA疫苗制备方法，并应用与免疫。
[0007]本专利技术实现了基于VEE病毒复制子的疫苗，设计构建基于VEE的表达新型冠状病毒刺突蛋白融合前稳定三聚体蛋白(Spike Trimer，S
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Trimer)的复制型mRNA疫苗，提供了一种预防或治疗的新型冠状病毒感染的表达刺突蛋白融合前稳定三聚体蛋白的mRNA疫苗制备方法及其应用。
[0008]一种重组复制型mRNA合成质粒，包括质粒骨架、复制酶基因和编码新型冠状病毒S蛋白突变体的基因；
[0009]其中，与野生型新型冠状病毒S蛋白相比，所述新型冠状病毒S蛋白突变体包含以下突变：
[0010](a)消除或破坏了位于氨基酸序列第682至685位的Furin蛋白酶酶切位点的突变；
[0011](b)促进新型冠状病毒S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变。
[0012]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)也称为新冠病毒，包括病毒突变株，如Delta毒株和Omicron BA.1毒株等具有更强的感染能力和更强免疫逃逸能力的突变株等。
[0013]其中，新冠病毒的刺突蛋白也称为S蛋白，所述S蛋白是冠状病毒最大的结构蛋白Spike，位于病毒粒子表面呈刺突状，在病毒颗粒与受体的结合和诱导抗体产生过程中发挥重要功能。在新冠病毒S蛋白中，S1亚基和S2亚基的连接处存在Furin蛋白酶酶切位点，细胞膜表面Furin蛋白酶剪切该酶切位点，使得S蛋白的S1结构域解离脱落，剩下的S2结构域负责病毒膜与细胞膜的膜融合作用，即为融合后构象。新冠病毒的S蛋白在病毒表面呈现三聚体结构，即由三个S1亚基和三个S2亚基构成，而S蛋白三聚体形式是其天然形态，如果阻断S蛋白与受体的结合，新冠病毒将无法入侵细胞。
[0014]在本专利技术中，表述“融合前稳定三聚体构象”是指包含新冠病毒S蛋白的氨基酸序列Furin蛋白酶酶切位点的突变，和包含S蛋白羧基末端连接三聚体基序。
[0015]其中，消除或破坏Furin蛋白酶酶切位点的突变为在氨基酸序列第682至685位的一个或多个氨基酸位置处的添加、删除、和/或取代；优选地，所述突变为R682G/R683S/R685S取代，使S蛋白保持融合前构象。
[0016]所述促进新型冠状病毒S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变为K986P/V987P和F817P/A892P/A899P/A942P取代。
[0017]所述新型冠状病毒S蛋白突变体还包含促进S蛋白释放的突变；
[0018]优选地，所述促进S蛋白释放的突变包括删除新型冠状病毒S蛋白氨基酸序列第1209至1273位的氨基酸，以稳定S蛋白三聚体构象并且不干扰S蛋白的正常折叠；并在新型冠状病毒S蛋白的C末端添加基序；
[0019]更为优选地，基序为T4或GCN4基序。
[0020]为了提高VEE
‑
S
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Trimer
‑
mRNA疫苗进入体内后表达S蛋白的水平，编码新型冠状病毒S蛋白突变体的基因序列是经过密码子优化的；优选地是针对哺乳动物密码子优化的。
[0021]其中，表达密码子序列优化融合前三聚体S蛋白的mRNA序列大小为11445bp(如SEQ ID NO.2所示)，包含S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变。
[0022]所述质粒骨架包括T7启动子序列、5
’
UTR区、3
’
UTR区和3
’
末端Poly(A)尾；优选地，3
’
末端Poly(A)尾的末端包含一个用于质粒线性化制备的限制性内切酶位点。
[0023]所述非结构蛋白基因编码区来源于甲病毒；所述复制酶基因为复制酶基因1
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4编码区，包含VEE病毒复制酶基因序列；优选地，所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒。
[0024]本专利技术还提供了所述的重组复制型mRNA合成质粒在制备预防新型冠状病毒感染引起的肺炎的疫苗中的应用。
[0025]本专利技术还提供了一种表达新型冠状病毒S蛋白融合前稳定三聚体蛋白的复制型mRNA，包括5
’
UTR区、3
’
UTR区和3
’
末端PolyA尾、复制酶1
‑
4编码区序列、编码新型冠状病毒S
蛋白突变体的mR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组复制型mRNA合成质粒，其特征在于，包括质粒骨架、复制酶基因和编码新型冠状病毒S蛋白突变体的基因；其中，与野生型新型冠状病毒S蛋白相比，所述新型冠状病毒S蛋白突变体包含以下突变：(a)消除或破坏了位于氨基酸序列第682至685位的Furin蛋白酶酶切位点的突变；(b)促进新型冠状病毒S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变。2.如权利要求1所述的重组复制型mRNA合成质粒，其特征在于，所述新型冠状病毒为Alpha毒株，Delta毒株和Omicron BA.1毒株。3.如权利要求1所述的重组复制型mRNA合成质粒，其特征在于，所述消除或破坏Furin蛋白酶酶切位点的突变为R682G/R683S/R685S取代；所述促进新型冠状病毒S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变为K986P/V987P和F817P/A892P/A899P/A942P取代。4.如权利要求3所述的重组复制型mRNA合成质粒，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白突变体还包括删除新型冠状病毒S蛋白氨基酸序列第1209至1273位的氨基酸，并在新型冠状病毒S蛋白的C末端添加基序；基序为T4或GCN4基序。5.如权利要求1所述的重组复制型mRNA合成质粒，其特征在于，所述质粒骨架包括T7启动子序列、5
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨永乐，黄耀伟，唐建斌，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：