同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，特别是指同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL

【技术实现步骤摘要】
同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL
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18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及重组猪伪狂犬病毒株，特别是指同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL
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18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起猪的一种高度接触性肠道传染病，主要临床表现为呕吐、水样腹泻、脱水和哺乳仔猪死亡率高，多见于冬春寒冷季。该病在世界范围内均有发生，尤其以欧洲和亚洲最为严重。自我国猪场使用PEDV CV777疫苗以来，已很好地控制PED。然而，自2010年12月以来，包括中国在内的多个国家许多养猪场暴发流行新一轮PED疫情，各个年龄段的猪均发生腹泻，尤其2周龄内仔猪最为严重，其病死率高达90%
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100%。2013年，美国首次暴发PED，并迅速蔓延到全美。新的疫情给全球养猪业造成了巨大的经济损失。基因序列分析结果显示，我国新发的PEDV流行毒株与2013年美国暴发的PEDV流行毒株基因序列高度相似，而与我国长期使用的PEDV CV777疫苗株在S基因存在较多变异，特别是S蛋白N段区域高度变异。本实验室从2016年采自河南省开封市某免疫过疫苗猪场病死猪肠道组织及内容物中分离到一株PEDV，命名为CH
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HNKF
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2016株（登录号KY649107），并对其进行全基因组测序和遗传进化分析。结果显示，该毒株与国内近年分离的PEDV变异株同源性最高，且在进化树中与国内近年来分离的PEDV变异毒株位于一个分支。
[0003]伪狂犬病（Pseudorabies, PR），即奥耶兹氏病（Aujeszky
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s disease）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起牛、羊、猪等多种家畜及野生动物的一种急性高度接触性传染病。PR的主要症状为发热、奇痒、脑脊髓炎、神经及繁殖系统障碍。目前尚无治疗PR的药物，只能采用接种如PRV Bartha K61等弱毒疫苗来防控PR，有效保护易感猪，PRV基因缺失疫苗和与其配套的鉴别诊断技术推动了PRV野毒株在猪场中的净化。然而，自2011年底以来，中国许多免疫Bartha K61的养猪场暴发新一轮PR。发病猪场中大约60% 的3
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7日龄仔猪出现中枢神经系统疾病，死亡率为100%，给养猪业造成巨大的经济损失。许多学者已从免疫过PR疫苗的死亡仔猪和流产胎儿中分离到PRV，并对其进行测序与遗传进化分析，以及仔猪的致病性试验。结果显示，PRV流行株处于一个相对独立分支，与以往国内外的PRV分离株及Bartha K61等常用疫苗株的遗传关系较远，且对仔猪的致病性更强。PRV流行株的抗原性已经发生了变异，Bartha K61等常用弱毒疫苗已不能完全保护PRV流行变异株的感染。
[0004]本实验室从2012年采自河南省南阳市某免疫过PRV Bartha K61疫苗猪场病死猪体内分离到一株PRV野毒株，命名为PRV/HN2012株(CCTCC NO.V201314)。基于gE、gB、gC基因的同源性和遗传进化分析结果显示，该分离株与国内近年分离的PRV流行变异株同源性最高，且在进化树中与国内近年来分离的PRV流行变异毒株处于同一个分支中，可作为疫苗开发的一个新方向。我们对PRV/HN2012株进行TK/gE/gI三基因缺失，获得PRV流行变异株三基因缺失突变株rPRV HN2012
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TK
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/gE
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/gI
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。试验证实，rPRV HN2012
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TK
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/gE
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/gI
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使小鼠机体
产生了较高滴度的PRV特异性抗体，小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定也显示其成功激活了小鼠机体的细胞免疫，且对PRV/HN2012株的攻击具有100%的抵抗力，为我国根除PR创造条件。
[0005]猪白细胞介素18（Interleukin 18，IL
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18）由单核巨噬细胞以及树突细胞产生的一种多效性细胞因子，Kayamuro等研究发现发现IL
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1家族可同时促进Th1型和Th2型免疫应答，且巨噬细胞与DC一样是佐剂发挥作用的靶细胞，说明猪IL
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18可以作为疫苗佐剂来发挥调节作用。因此，猪IL
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18可以作为一种天然免疫调节剂和疫苗免疫增强剂。
[0006]PEDV和PRV是最重要的两种猪病毒，迄今尚无同时预防猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的疫苗，因此研制这两种病毒的重组疫苗对生产实践具有重要意义，同时以猪IL
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18作为分子佐剂，具有免疫增强作用。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL
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18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用，以PEDV变异株CH
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HNKF
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2016株为研究对象，首先构建含有PEDV变异株CH
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HNKF
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2016的S1基因CS表位区和猪IL
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18的重组转移质粒pG
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CS
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IL18（含有EGFP荧光标签），以表达绿色荧光蛋白的EGFP作为筛选标记，用当前流行的PRV变异株三基因缺失突变株rPRV HN2012
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TK
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/gE
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/gI
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感染ST细胞后，将重组转移质粒pG
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CS
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IL18转染ST细胞，发生同源重组，通过筛选带有绿色荧光蛋白的蚀斑，纯化获得表达绿色荧光的重组病毒rPRV
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PEDV S1
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IL18
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EGFP。再利用CRISPR/Cas9质粒敲除载体（PX459
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gRNA1
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EZ
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gRNA3
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EGFP）去除荧光标签EGFP基因，成功获得重组病毒rPRV
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PEDV S1
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IL18。
[0008]本专利技术采用以下具体方案：同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL
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18的重组猪伪狂犬病毒株，其分类名为rPRV
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PEDV S1
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IL18，保藏号为：CCTCC NO：V201740，保藏日期：2017年10月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0009]所述猪伪狂犬病毒株包含有P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL
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18的重组猪伪狂犬病毒株，其分类名为rPRV
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PEDV S1
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IL18，保藏号为：CCTCC NO：V201740，保藏日期：2017年10月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学。2.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述猪伪狂犬病毒株包含有PEDV变异株CH
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HNKF
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2016的S1基因CS表位区和猪IL
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18基因。3.根据权利要求2所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述PEDV变异株CH
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HNKF
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2016的S1基因CS表位区序列如SEQ ID No.1所示。4.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述重组猪伪狂犬病毒株选用变异株PRV/HN2012株，保藏号为：CCTCC NO.V201314，并将其gI、gE、TK基因缺失而获得的PRV流行变异株三基因缺失突变株rPRV HN2012
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TK
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/gE
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/gI
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，保藏号为：CCTCC NO.V201748，作为活病毒载体。5.根据权利要求4所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述重组猪伪狂犬病毒株选用变异株PRV/HN2012株的gG糖蛋白作为插入位点，通过先删除在gG基因上第23bp
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438bp的共计416 bp的片段，再利用gG启动子表达PEDV 的CS表位区。6.根据权利要求5所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述gG基因序列如SEQ ID No.2所示。7.权利要求1
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6任一项所述的重组猪伪狂犬病毒株的构建方法，其特征在于，步骤如下：（1）分别根据PEDV变异株S1基因CS区基因序列、猪IL
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18基因序列、以及pBApo
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EF1alpha_Pur_DNA质粒的序列设计引物对CS
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F/CS
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R，IL18
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(BamH I)F/IL18
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(Hind III)R，及pBApo(BstZ17I)
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F/pBApo(BstZ17I)
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R；（2）以PEDV变异株的cDNA为模板，以步骤（1）的引物对CS
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F/CS
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R为引物，进行扩增、酶切并回收CS区目的片段；（3）以pBApo
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EF1alpha_Pur_DNA质粒为模板，以步骤（1）的引物对pBApo(BstZ17I)
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F/pBApo(BstZ17I)
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R为引物，进行扩增、酶切并回收pG载体；（4）连接步骤（2）和步骤（3）回收的pG载体与CS区片段并转化简单，获得pBApo
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EF1alpha_Pur_DNA真核...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑兰兰，陈红英，崔建涛，韩昊莹，张远航，陈曦艋，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：