一种鸡传染性喉气管炎重组病毒株及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种鸡传染性喉气管炎重组病毒株及其应用，所提供的鸡传染性喉气管炎重组病毒株是将鸡传染性喉气管炎强毒株的ORFC基因进行缺失，通过同源重组拯救后筛选获得的。其中一种具体的传染性喉气管炎重组病毒，其保藏号为CCTCC NO：C202158。本发明专利技术提供的传染性喉气管炎重组病毒用于制备疫苗。本发明专利技术所提供的ILTV基因缺失弱毒株，致病力显著弱于亲本株，免疫后所引起的副反应显著小于现有的疫苗株K317株，并可以对当前流行的ILTV提供良好的保护作用。保护作用。保护作用。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡传染性喉气管炎重组病毒株及其应用


[0001]本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及一种鸡传染性喉气管炎重组病毒株及其应用。
技术背景
[0002]鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是由传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的一种急性呼吸道传染病。该病具有高度接触性，传染性的特点，其特征为呼吸困难、咳嗽，咳出含有血液的渗出物，喉部和气管粘膜肿胀、出血并形成糜烂。由于感染鸡的死亡和产蛋下降等，给养禽业造成严重的经济损失。ILT于1925年首次被May和Tittsler报道于美国，随后在世界各地均有报道发生，我国在1950年后发生本病。
[0003]传染性喉气管炎病毒ILTV的宿主范围较窄，主要感染宿主是鸡。虽然该病毒可以感染所有年龄的鸡，但以成年鸡最易感。接触性感染是该病主要的传播方式，但病毒液可以通过口咽途径或呼吸道、眼睛进入鸡体。本病一年四季均可发生，主要表现为夏季发病少，冬春季节发病较多，饲养环境拥挤、饲养管理条件差均可促进本病的发生。
[0004]ILTV能在某些原代细胞上繁殖，如鸡胚肝细胞(CEL)，鸡胚肾细胞(CEK)、鸡肾细胞(CK)和鸡胚肺细胞等。研究证明，鸡肝癌细胞(LMH)能使ILTV得到适应，并能良好繁殖生长。LMH细胞是患肝细胞癌的鸡的肝细胞经二乙基亚硝胺致突变而筛选得到的，已经成功的用于ILTV重组病毒的构建。与原代细胞相比，LMH细胞生长速度快，易于培养和传代，并且可以液氮保存，LMH细胞系不会有其它不适于ILTV增殖的细胞的污染。但是ILTV在鸡胚上增殖的效率最高，因此，目前常用的ILTV培养方法仍然是鸡胚，通过尿囊腔或绒毛尿囊膜(CAM)接种ILTV，在接种后48h即可观察到许多个中央凹陷、边缘不透明的痘斑，一般在72h
‑
120h鸡胚死亡。
[0005]自然感染或接种疫苗后，易感鸡对ILTV的抵抗力就发生了改变。ILTV感染后7天，在血清中就能检测到中和抗体，21天左右抗体水平达到高峰。虽然体液免疫与感染有关，但对于ILTV的感染，它并不是主要的保护机制，而是以细胞介导的免疫为主。喉气管炎母源抗体虽能经卵传给子代，但不能提供保护作用，也不干扰鸡的免疫接种。因此对于本病的预防，使用疫苗是最行之有效的方法。
[0006]灭活疫苗制作简单，易随时制备，安全且不受母源抗体的干扰。但灭活疫苗主要诱导体液免疫，诱发细胞免疫的作用不强，免疫保护效果有限，现在大规模防治ILTV时几乎不使用灭活疫苗。使用最多的是鸡胚源或组织源的弱毒疫苗。
[0007]常规弱毒活疫苗一般通过体外传代而减毒制得，但是在实际使用中，这些弱毒株的减毒程度难以控制，存在毒力不稳定的问题，有时弱毒疫苗株能够返祖成为强毒株，成为新的传染源。这也是ILTV一直无法根治的重要原因。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种鸡传染性喉气管炎重组病毒株及其应用，所提供的鸡传
染性喉气管炎重组病毒株作为弱毒株用于制备疫苗。
[0009]本专利技术首先提供一株鸡传染性喉气管炎病毒弱毒株，是将鸡传染性喉气管炎强毒株的ORFC基因进行缺失，通过同源重组拯救后筛选获得的；
[0010]所述ORFC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ORFC基因缺失后的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0011]本专利技术还提供了上述鸡传染性喉气管炎基因缺失株的构建方法，包括以下步骤：
[0012]1)分别将鸡传染性喉气管炎强毒株的ICP4蛋白基因和UL48蛋白基因连接到载体构建辅助质粒；
[0013]所述的载体，一种实施例的具体记载为PCI
‑
neo载体；
[0014]2)构建含有AcGFP表达盒的重组转移载体：通过PCR扩增分别获得传染性喉气管炎病毒ORFC基因两侧的左同源臂ORFC
‑
L和右同源臂ORFC
‑
R，PCR扩增获得AcGFP表达盒片段；将3个片段按顺序插入载体pBluescript II KS(+/
‑
)，获得转移载体L
‑
AcGFP
‑
R
‑
pBluescript，载体中AcGFP表达盒上下游分别连有左同源臂ORFC
‑
L与右同源臂ORFC
‑
R；
[0015]所述的左同源臂ORFC
‑
L的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，右同源臂ORFC
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，AcGFP表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
[0016]3)获取传染性喉气管炎病毒强毒株的完整基因组DNA；
[0017]4)分别将获取的传染性喉气管炎病毒强毒株的基因组DNA与1)中构建的辅助质粒和2)中构建的转移载体共转染宿主细胞，通过极限稀释法获得表达AcGFP荧光基因的传染性喉气管炎重组病毒。
[0018]所述的宿主细胞，作为实施例的一种具体记载，为LMH细胞。
[0019]5)LMH细胞转染表达cre重组酶的质粒pBS513EF1alpha
‑
cre，24h后接种表达AcGFP荧光基因的传染性喉气管炎重组病毒；培养96h后用极限稀释法筛选获得不含荧光基因的传染性喉气管炎重组病毒。
[0020]其中一种传染性喉气管炎重组病毒，为鸡传染性喉气管炎病毒rILTV/L株，于2021年8月4日保藏在位于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202158；
[0021]本专利技术提供的传染性喉气管炎重组病毒用于制备疫苗；
[0022]本专利技术再提供一种ILTV ORFC基因缺失株弱毒疫苗，所用的抗原为上述的传染性喉气管炎重组病毒弱毒株。
[0023]本专利技术所提供的ILTV基因缺失弱毒株，致病力显著弱于亲本株，免疫后所引起的副反应显著小于现有的疫苗株K317株，并可以对当前流行的ILTV提供良好的保护作用。
附图说明
[0024]图1：ILTV分离株的PCR鉴定图，
[0025]图2：转移载体的构建图，
[0026]图3：辅助质粒的构建图，
[0027]图4：重组病毒的荧光筛选图，
[0028]图5：重组病毒与亲本病毒的生长曲线图。
具体实施方式
[0029]本专利技术公开了一种ORFC基因缺失的鸡传染性喉气管炎病毒重组疫苗株及其构建方法和应用，是对ILTV强毒株进行基因缺失，运用同源重组技术删除其ORFC基因并通过极限稀释的方法，筛选获得遗传稳定的弱毒株。
[0030]本专利技术构建获得的ILTV重组弱毒株克服了ILTV传统疫苗株免疫后副反应大、并有效的降低了疫苗株毒力返强的风险，免疫原性没有受到影响，与传统疫苗株相当。
[0031]下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。
[0032]实施例1鸡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鸡传染性喉气管炎病毒弱毒株，其特征在于，所述的弱毒株是将鸡传染性喉气管炎强毒株的ORFC基因进行缺失，再通过同源重组拯救后筛选制备的。2.如权利要求1所述的弱毒株，其特征在于，所述的ORFC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。3.如权利要求1所述的弱毒株，其特征在于，所述的ORFC基因进行缺失，缺失后的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。4.权利要求1所述的弱毒株的构建方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)分别将鸡传染性喉气管炎强毒株的ICP4蛋白基因和UL48蛋白基因连接到载体构建辅助质粒；2)构建含有AcGFP表达盒的重组转移载体：通过PCR扩增分别获得传染性喉气管炎病毒ORFC基因两侧的左同源臂ORFC
‑
L和右同源臂ORFC
‑
R，PCR扩增获得AcGFP表达盒片段；将3个片段按顺序插入载体获得转移载体，载体中AcGFP表达盒上下游分别连有左同源臂ORFC
‑
L与右同源臂ORFC
‑
R；3)获取传染性喉气管炎病毒强毒株的完整基因组DNA；4)分别将获取的传染性喉气管炎病毒强毒株的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙化露，楚电峰，于晓璐，郭伟伟，侯玉超，李振，孙鹏，杜元钊，范根成，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：