一种重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用。所构建的重组病毒同时缺失了MDV致病、致肿瘤相关的两个主要基因RLORF6、Meq和CmR基因，相比缺失单一基因，极大增加了疫苗安全性，降低了野外获得缺失基因的能力；重组病毒株基因组没有抗性基因，符合国内外生物制品行业的严格要求；重组病毒具有良好的生物安全性，具有更为有效的抗MDV的免疫保护效果，尤其适用我国鸡群MDV的免疫。重组病毒能够有效的与野毒进行区分，并且其水平传播能力较弱，不仅对鸡群MDV的免疫具有极大的应用价值，更是有利于推进MDV的净化，重组病毒株基因组没有FRT序列，减少了外源基因对病毒生物学活性的影响，避了FRT序列间病毒基因片段的任意剪切，更有利于研制重组活病毒载体疫苗。更有利于研制重组活病毒载体疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用


[0001]本专利技术涉及一种重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用，属于兽用生物制品分子生物学领域。

技术介绍

[0002]鸡马立克病(Marek
’
s disease，MD)是由鸡马立克病病毒(Marek
’
s disease virus，MDV) 感染雏鸡引发的一种重要的免疫抑制与肿瘤病。MDV感染宿主后引起免疫抑制是导致其它疾病疫苗免疫失败的重要因素。疫苗的使用能够有效的预防鸡群MDV肿瘤的发生，但是随着免疫压力选择及MDV自身演化，目前临床广泛使用的商品化MDV疫苗CVI988/Rispens呈现不能完全保护的趋势。近年来，即使免疫MDV疫苗的鸡场也时常爆发MD疫情，表明我国鸡群 MDV野生毒株的毒力在不断增强。因此，研制免疫效果更好的MDV疫苗成为养禽业的迫切需求。
[0003]然而，利用传统的细胞传代致弱毒力的方法研制的MDV疫苗无法提供比现有的 CVI988/Rispens更好的免疫效果。现代分子生物学技术的快速发展，有效的推进了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株重组马立克病毒MDLV21，其特征在于所述病毒是缺失RLORF6、Meq和CmR基因的重组马立克病毒株，该株病毒已于2021年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.20389。2.一株马立克病毒MDLV21的构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)构建用于取代RLORF6和Meq基因的重组穿梭质粒——根据马立克病毒标准株Md5全基因序列(GeneBank登录号为No.NC002229)，针对RLORF6和Meq基因作为同源臂的旁侧序列分别设计引物RLORF6
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F/R和Meq
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F/R，并设计扩增EGFP蛋白表达盒的引物EGFP
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F/R，以利用马立克病毒SCA13(已于2018年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为：CGMCC No.15285)全基因组DNA作为模板，RLORF6
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F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因上游同源臂片段UP，Meq
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F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因下游同源臂片段DO，以PHA2质粒为模板利用引物EGFP
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F/R扩增EGFP蛋白表达盒，将扩增得到的上下游同源臂片段和EGFP蛋白表达盒进行连接克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC
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UGFPD；(2)构建用于缺失替代RLORF6和Meq基因的EGFP表达盒的重组穿梭质粒——针对RLORF6和Meq基因作为同源臂的旁侧序列分别设计引物RLORF6
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F/R1和Meq
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F/R，利用马立克病毒SCA13株全基因组DNA作为模板，RLORF6
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F/R1引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因上游同源臂片段UP；Meq
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F/R引物扩增靶标基因RLORF6、Meq基因下游同源臂片段DO，将扩增得到的上下游同源臂片段克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC
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UD；(3)构建用于取代氯霉素抗性基因(CmR)的重组穿梭质粒——以马立克病毒SCA13株全基因组DNA作为模板，设计引物CamUP
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F/R并扩增靶标基因CmR基因上游同源臂片段Cam
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UP，设计引物CamDO
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F/R并扩增靶标基因CmR基因下游同源臂片段Cam
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DO；以PHA2质粒为模板利用引物EGFP
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F1/R1扩增EGFP蛋白表达盒；将扩增得到的上下游同源臂片段、EGFP蛋白表达盒克隆进HindIII、EcoR I双酶切的PUC18载体，然后转化进DH5a大肠杆菌；提取质粒，鉴定正确后得到重组穿梭质粒PUC
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CamUGFPD；(4)构建用于缺失替代CmR基因的EGFP表达盒的重组穿梭质粒——针对靶标基因，设计扩增作为同源臂的旁侧序列引物CamUP
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F/R1、CamDO
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F1/R，以马立克病毒SCA13株全基因组DNA作为模板，引物CamUP
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F/R...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏帅，崔宁，成子强，王淑雯，李久庆，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：