一种多基因融合溶瘤腺病毒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种多基因融合溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒以Adeasy载体系统为基础，插入DCN基因表达框、腺病毒复制调控基因序列及CD40L基因表达框。本发明专利技术以溶瘤腺病毒为载体，联合靶向TGFβ和靶向CD40

【技术实现步骤摘要】
一种多基因融合溶瘤腺病毒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种多基因融合溶瘤腺病毒及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]近年来,我国结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势,仅次于肺癌,位居第二位。目前，结直肠癌的主要治疗手段是手术切除治疗，放射治疗和化学治疗的效果并不理想。因此，急需探索一种更加有效的治疗手段。
[0003]近年来，溶瘤病毒治疗发展迅速，已有多项溶瘤病毒治疗药物进入临床II
‑
III期研究阶段。2015年10月，美国FDA批准了携带粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte
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macrophage colony stimutaing factor，GM
‑
CSF)的单纯疱疹溶瘤病(T
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VEC)进入市场，为溶瘤病毒治疗注入了一支强心针。目前，在临床试验中应用最为广泛的是溶瘤腺病毒，我国早在2006年，我国就批准了全球第一个溶瘤腺病毒药物上市。溶瘤腺病毒的主要构建策略之一，是用组织特异性启动子替换天然的病毒启动子来控制病毒复制启动基因的表达，得到转录调控型的溶瘤腺病毒。
[0004]在理论上，溶瘤腺病毒可以在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，释放病毒，进一步感染周围的其他肿瘤细胞，进而发挥级联放大作用，最终达到消灭肿瘤的目的。然而，实际上，溶瘤腺病毒的疗效往往受到多种因素的制约，如，人体内普遍存在5型腺病毒抗体，可清除溶瘤溶瘤腺病毒；启动病毒复制的肿瘤特异性启动子效率达不到预想等。
[0005]近年来，通过多种方式对溶瘤腺病毒进行修饰，能够显著提高溶瘤腺病毒的疗效，如通过携带自杀基因，提高对肿瘤细胞的杀伤效率；通过携带免疫基因，调节机体及肿瘤局部的免疫状态；通过携带抗血管生成基因，阻断肿瘤细胞转移相关信号激活等。因此，将溶瘤腺病毒治疗与基因治疗联合应用，已经成为溶瘤病毒治疗的重要方向和热点。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一个目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供一种多基因融合溶瘤腺病毒；本专利技术的第二个目的是提供一种上述多基因融合溶瘤腺病毒的构建方法；本专利技术的第三个目的是提供一种上述多基因融合溶瘤腺病毒在制备用于治疗结直肠癌的药物中的应用。
[0007]本专利技术的第一个目的可通过下列技术方案来实现：一种多基因融合溶瘤腺病毒，包括该溶瘤腺病毒以Adeasy载体系统为基础，插入DCN基因表达框、腺病毒复制调控基因序列及CD40L基因表达框。
[0008]可选的，所述DCN基因表达框、腺病毒复制调控基因序列及CD40L基因表达框均插入在腺病毒基因组E1区中。
[0009]可选的，所述DCN基因表达框由cmv启动子和DCN基因组成。
[0010]可选的，所述CD40L基因表达框由天然E1B启动子和CD40L基因组成。
[0011]可选的，所述腺病毒复制调控基因序列包括端粒酶启动子TERTp、腺病毒E1区复制起始基因E1A及E1B55K，其中所述的腺病毒E1A基因由端粒酶启动子TERTp调控，所述E1B55K由天然E1B启动子调控。
[0012]优选的，所述CD40L基因插入至天然E1B启动子和E1B55K之间，即天然E1B启动子同时调控CD40L基因和E1B55K基因。
[0013]优选的，从序列的5
’
至3
’
方向为：cmv启动子
‑
DCN基因
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TERTp
‑
腺病毒E1A基因
‑
天然E1B启动子
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CD40L基因
‑
IRES
‑
E1B55K。
[0014]本专利技术的第二个目的可通过下列技术方案来实现：一种如上述的多基因融合溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
[0015]S1：将DCN基因插入到pshuttle
‑
cmv载体中，获得pSh.cmv.DCN；
[0016]S2：端粒酶启动子TERTp、腺病毒E1A基因、天然E1B启动子、CD40L基因、核糖体内部进入位点及E1B55K顺次相连，克隆到TE载体上获得TE
‑
TP
‑
E1A
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CD40L，酶切TE
‑
TP
‑
E1A
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CD40L后获取复制相关基因，将所述复制相关基因克隆到pSh.cmv.DCN的相应位点，获得穿梭质粒；
[0017]S3：酶切穿梭质粒,电转感受态细胞，与Adeasy
‑
1同源重组获得重组腺病毒质粒；酶切重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞，获得溶瘤腺病毒。
[0018]本专利技术的第三个目的可通过下列技术方案来实现：一种如上述多基因融合溶瘤腺病毒在制备用于治疗结直肠癌的药物中的应用。该药物用于结直肠癌治疗，包括TGF
‑
β不敏感的结直肠癌治疗。
[0019]本专利技术的第四个目的可通过下列技术方案来实现：一种如上述多基因融合溶瘤腺病毒在肿瘤治疗及药物研发中的应用。
[0020]综上所述，本专利技术的有益效果为：
[0021]1、本专利技术以溶瘤腺病毒为载体，联合靶向TGFβ和靶向CD40
‑
CD40L的治疗策略，协同发挥其抗肿瘤免疫激活效应，提升结直肠癌的治疗水平。肿瘤局部给药后，首先通过溶瘤作用杀灭肿瘤细胞；同时不断复制的病毒能够持续产生大量的目的蛋白decorin和CD40L。局部高浓度的decorin，可阻断肿瘤细胞内异常激活的TGFβ信号，抑制转移相关蛋白的表达与分泌。同时，CD40L能够激活机体抗肿瘤免疫反应、抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡。协同发挥其在改善肿瘤免疫微环境和激活机体抗肿瘤免疫反应中的作用，更加长效地发挥溶瘤病毒的作用。
[0022]2、本专利技术将TGFβ天然抑制分子decorin和CD40L联合应用于肿瘤的免疫基因治疗，可有效结合溶瘤治疗、基因治疗和免疫治疗的优势，有望协同发挥其在改善肿瘤免疫微环境和激活机体抗肿瘤免疫反应中的作用，为结直肠癌的治疗提供一种更加有效的策略，具有十分重要的理论意义和现实价值。
附图说明
[0023]图1为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L以及对照病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.CD40L和Ad.Null的基因组结构示意图。
[0024]图2为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L对结直肠癌细胞系RKO、HCT116和CT26的杀伤作用图。
[0025]图3为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L介导目的基因DCN和CD40L表达的能力图。
[0026]图4为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L治疗CT26移植瘤的治疗效果图。
[0027]图5为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L治疗7天后外周血中Tregs细胞的检测结果图。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多基因融合溶瘤腺病毒，其特征在于，该溶瘤腺病毒以Adeasy载体系统为基础，插入DCN基因表达框、腺病毒复制调控基因序列及CD40L基因表达框。2.根据权利要求1所述的一种多基因融合溶瘤腺病毒，其特征在于，所述DCN基因表达框、腺病毒复制调控基因序列及CD40L基因表达框均插入在腺病毒基因组E1区中。3.根据权利要求1所述的一种多基因融合溶瘤腺病毒，其特征在于，所述DCN基因表达框由cmv启动子和DCN基因组成。4.根据权利要求3所述的一种多基因融合溶瘤腺病毒，其特征在于，所述CD40L基因表达框由天然E1B启动子和CD40L基因组成。5.根据权利要求4所述的一种多基因融合溶瘤腺病毒，其特征在于，所述腺病毒复制调控基因序列包括端粒酶启动子TERTp、腺病毒E1区复制起始基因E1A及E1B55K，其中所述的腺病毒E1A基因由端粒酶启动子TERTp调控，所述E1B55K由天然E1B启动子调控。6.根据权利要求5所述的一种多基因融合溶瘤腺病毒，其特征在于，所述CD40L基因插入至天然E1B启动子和E1B55K之间，即天然E1B启动子同时调控CD40L基因和E1B55K基因。7.根据权利要求5所述的一种多基因融合溶瘤腺病毒，其特征在于：从序列的5
’
至3
’
方向为：cmv启动子
‑
DCN基因
‑
TERTp
‑
腺病毒E1A基因
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨月峰，荣晔婧，蔡挺，张顺，张沛瑶，
申请(专利权)人：国科宁波生命与健康产业研究院，
类型：发明
国别省市：