一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法技术

本发明专利技术涉及药物筛选技术领域，且公开了一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，包括以下步骤：10mg/mL环磷酰胺溶液:取0.01g环磷酰胺粉末用10mL的无菌水震荡混匀,4℃冰箱备用，小鼠经动物房适应性饲养3天后开始实验，连续3天腹腔注射10mg/mL环磷酰胺溶液，第4天用带有萤光酶的重组基因的MCMV突变体(命名为Luc

【技术实现步骤摘要】
一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法


[0001]本专利技术涉及药物筛选
，具体为一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法。

技术介绍

[0002]光素酶是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinuspyralis的萤火虫体内的萤光素酶，在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷，没有萤光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应。
[0003]目前对于巨细胞病毒的预防尚未有有效疫苗上市，对于该病毒的感染临床治疗主要是抗病毒药物，现有的药物对人体的肝脏及肾脏损害较大，长时间服用也容易产生耐药性，筛选药物的方法复杂、周期长，而且重复性和准确性都不高，使用起来不方便，故而提出了一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法解决上述提出的问题。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，具备筛选药物周期短、筛选药物准确性高的优点，解决了筛选药物周期长、筛选药物准确性低的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述筛选药物周期短、筛选药物准确性高的目的，本专利技术提供如下技术方案：一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，包括以下步骤：
[0008]1)10mg/mL环磷酰胺溶液:取0.01g环磷酰胺粉末用10mL的无菌水震荡混匀,4℃冰箱备用；
[0009]2)小鼠经动物房适应性饲养3天后开始实验，连续3天腹腔注射10mg/mL环磷酰胺溶液，第4天用带有萤光酶的重组基因的MCMV突变体(命名为Luc
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MCMV)BA转染小鼠成纤维细胞，即NIH 3T3，收集细胞培养上清以及细胞裂解液，即为具有感染活性的Luc
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MCMV病毒；
[0010]3)将收获的具有感染活性的Luc
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MCMV病毒和野生型小鼠巨细胞病毒(命名为Wt
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MCMV)同时、分别感染NIH 3T3细胞，噬斑法测定病毒滴度，分别测定它们的滴度并绘制病毒生长曲线，比较Luc
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MCMV病毒和Wt
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MCMV病毒生长特性与生长曲线的关系；
[0011]4)用NIH 3T3细胞扩大病毒培养，收集细胞培养上清与细胞裂解液上清，合并两种上清，然后进行分级离心与超速离心，用Spectrum CT成像系统测定Luc
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MCMV在细胞中的萤光强度，即反映病毒在细胞中的复制与繁殖状况；
[0012]5)以更昔洛韦为对照药物，选择以往文献中具有潜在抗HCMV活性的中药单体，通过MTT实验确定各中药单体的最大无毒浓度，在安全药物浓度下进行后续抗病毒活性研究；
[0013]6)按MOI＝1加入Luc
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MCMV，Spectrum CT成像系统检测其发光强度，并用
Living软件定量发光值，分析各中药单体是否具有抗MCMV活性；
[0014]7)取小鼠唾液腺制备SG
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Luc
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MCMV，分别感染细胞和小鼠，评估GCV在体内外的抗MCMV的药物活性。
[0015]优选的，所述中药单体为黄芩素、黄芪甲苷、穿心莲内酯、绿原酸、槲皮素以及苦参碱。
[0016](三)有益效果
[0017]与现有技术相比，本专利技术提供了一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，具备以下有益效果：
[0018]1、该带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，通过利用带有萤光素酶基因的重组病毒，通过检测重组病毒中萤光素酶的萤光强度来反映病毒复制变化的情况，在通过添加不同的药物的情况下，在体内外通过检测病毒在体内外萤光变化的病毒复制情况，从而快速筛选出筛选抗MCMV活性的中药单体，进而减少了筛选药物的周期，解决了筛选药物周期长的问题。
[0019]2、该带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，通过利用生物萤光这这种方法能够快速筛选抗病毒药物的从而建立起细胞模型，通过在体外筛选出了和更昔洛韦具有相似抗MCMV活性的中药单体黄芩素和黄芪甲苷，提高了筛选中药单体黄芩素和黄芪甲苷的准确性，通过在GCV在动物中也能显著抑制Luc
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MCMV的复制与繁殖，表现出良好的抑制病毒的活性，解决了筛选药物准确性低的问题。
附图说明
[0020]图1为本专利技术唾液腺Luc
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MCMV制备示意图。
[0021]图2为本专利技术SG
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Luc
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MCMV抗病毒药物的细胞筛选示意图；
[0022]图3为本专利技术SG
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Luc
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MCMV抗病毒药物的动物筛选示意图；
[0023]图4为本专利技术Luc
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MCMV生物发光稳定检测示意图；
[0024]图5为本专利技术Luc
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MCMV与Wt
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MCMV病毒生长曲线示意图。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，如利用该方法进行抗HCMV药物筛选等，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]1、Luc
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MCMVBAC质粒的转染
[0027]复苏NIH 3T3细胞，待细胞生长约80％汇合度左右，转染前一天晚上种细胞至24孔板，调整细胞密度为1
×
104个/孔，细胞生长环境为含10％FBS DMEM、不含双抗的培养基和含5％CO2的37℃恒温培养箱中进行培养。转染前，吸弃原培养基后用PBS洗一次，再每孔加入200μl Opti
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MEM置于培养箱中孵育2h。准备转染溶液：溶液1(0.5μl Lipo 2000+55μl Opti
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MEM)，溶液2(1μl Lipo 2000+55μl Opti
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MEM)，溶液3(2μl Lipo 2000+55μl Opti
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MEM)，溶液A(Xμl Opti
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MEM+0.9μg/mL BAC质粒，含量分别为0.5μg/mL和1μg/mL)，均上下颠倒混匀。将溶液A分别缓慢加入到溶液1、2、3中，切勿吹打，继续上下颠倒混匀，室温静置
8.0作图。
[0041]9、唾液腺Luc
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MCMV的制备
[0042]小鼠经动物房适应性饲养3天后开始实验，连续3天腹腔注射10mg/mL环磷酰胺溶液，第4天经尾静本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)10mg/mL环磷酰胺溶液:取0.01g环磷酰胺粉末用10mL的无菌水震荡混匀,4℃冰箱备用；2)小鼠经动物房适应性饲养3天后开始实验，连续3天腹腔注射10mg/mL环磷酰胺溶液，第4天用带有萤光酶的重组基因的MCMV突变体(命名为Luc
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MCMV)BA转染小鼠成纤维细胞，即NIH 3T3，收集细胞培养上清以及细胞裂解液，即为具有感染活性的Luc
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MCMV病毒；3)将收获的具有感染活性的Luc
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MCMV病毒和野生型小鼠巨细胞病毒(命名为Wt
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MCMV)同时感染NIH 3T3细胞，噬斑法测定病毒滴度，分别测定它们的滴度并绘制病毒生长曲线，比较Luc
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MCMV病毒和Wt
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MCMV病毒生长特性与生长曲线的关系；4)用NIH 3T3细胞扩大病...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘如石，邱义兰，全梅芳，徐叶，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：