携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物医药工程技术领域，提供了一种携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用，该SIKE基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。重组溶瘤痘苗病毒的构建方法包括两个步骤：(A)将SIKE的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB

【技术实现步骤摘要】
携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种携带IKKε抑制因子(Suppressor of IKKε, SIKE或SIKE1)基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]溶瘤病毒是指能够选择性感染并损伤肿瘤组织的有治疗价值的病毒。溶瘤病毒有着悠久的历史，至今已有分属10个病毒家族的溶瘤病毒进入临床试验，包括腺病毒(Adenovirus)、柯萨奇病毒(Coxackie virus)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)、麻疹病毒(Measles virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、细小病毒(Parvovirus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)与水疱性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus)。目前已有疱疹病毒T-VEC被FDA批准治疗黑色素瘤。总体上，溶瘤病毒在临床试验中表现出了可观的安全性和有效性。
[0003]痘苗病毒是一种有被膜的双链DNA病毒，相比其他溶瘤病毒有以下几个优点：(1) 其在DNA病毒中是独一无二的，因为它只在细胞质中复制，以尽量减少整合在宿主基因组内的风险；(2)痘苗病毒最早被制成疫苗来对抗天花病毒，其安全性有较大的保障； (3)痘苗病毒的克隆能力大，可以允许较大长度的基因片段的插入；(4)痘苗病毒在实验动物和人体上均表现出向癌组织靶向性聚集的能力。因此痘苗病毒已成为癌症治疗的理想病毒载体。
[0004]目前常见的溶瘤痘苗病毒大都经过减毒改造，包括胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase， TK)基因缺失或TK/痘苗病毒生长因子基因双缺失的病毒株等。TK基因的缺失使痘苗病毒的复制更依赖于细胞内的TK水平，而癌细胞相比于正常细胞往往具有更高水平的TK；另外，痘苗病毒的复制还依赖于表皮生长因子受体EGFR/Ras通路的驱动，从而使其对癌细胞具有很强的选择性。
[0005]IKKε抑制因子(Suppressor of IKKε,SIKE或SIKE1)是一个参与调节IKKε及TBK1 信号通路的因子，过表达SIKE可抑制IKKε与TBK1介导的抗水疱性口炎病毒的应答 (Huang,J.,T.Liu,et al.2005.SIKE is an IKK epsilon/TBK1-associated suppressor of TLR3
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and virus-triggered IRF-3 activation pathways.EMBO J 24(23):4018-4028.)。SIKE通过与转录因子IRF3竞争与TBK1的互作，从而抑制TBK1对IRF3的磷酸化和激活(Marion,J. D.,C.F.Roberts,et al.2013.Mechanism of endogenous regulation of the type I interferonresponse by suppressor of IkappaB kinase epsilon(SIKE),a novel substrate of TANK-bindingkinase 1(TBK1).J Biol Chem 288(25):18612-18623.)。可见，SIKE某种程度上参与了细胞对某些病毒感染的应答。然而，SIKE是否具有抗肿瘤作用尚未见报道，利用溶瘤痘苗病毒作为载体来外源表达SIKE是否可应用于肿瘤治疗是个有待解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术是为解决上述技术问题进行的，通过将SIKE基因与溶瘤痘苗病毒进行结合，达到了对荷瘤小鼠更优的治疗效果，因而提供一种携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。
[0007]本专利技术的第一方面提供了一种携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒，该溶瘤痘苗病毒携带 SIKE基因(GenBank:NM_025073.2)，SIKE基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示：
[0008]atgagctgcaccatcgagaagatcctgacagacgccaagacgctgctggagaggctacgggagcacgatgcggccgccgagt cgctggtggatcagtcggcggcgctgcaccggcgggtagcagctatgcgggaggcggggacagcgcttccggaccagtatcaagag gatgcatccgatatgaaggacatgtccaaatacaaacctcacattctgctgtcccaagagaacacacagattagagacttgcaacaggaa aacagagagctatggatttccttggaggaacaccaggatgctttggaacttatcatgagcaaatatcggaaacagatgttacagttaatggtt gctaaaaaagcggtggatgctgaaccagtcctgaaagctcaccagtctcactctgcagaaattgagagtcagattgacagaatctgtgaaa tgggagaagtgatgaggaaagcagttcaggtggatgatgaccagttttgtaagattcaggaaaaattagcccaattagagcttgaaaataa ggaacttcgagaattattgtccatcagcagtgagtctcttcaagccagaaaggaaaactcaatggacactgcttcccaagccatcaaataa
[0009]优选的，痘苗病毒为痘苗病毒Western Reserve株、痘苗病毒天坛株、痘苗病毒Wyeth 株、痘苗病毒Copenhagen株、痘苗病毒Lister株或痘苗病毒NYCBH株。
[0010]本专利技术的第二方面提供了一种携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒的构建方法，该构建方法包括如下两个大步骤：(A)将SIKE的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-SIKE质粒；(B)pCB-SIKE质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒。
[0011]优选的，步骤(B)中为痘苗病毒Western Reserve株和pCB-SIKE质粒的重组，构建获得oncoVV-SIKE痘苗病毒。
[0012]在本专利技术的构建方法中，步骤(A)和步骤(B)中均可采用常规操作方法进行操作。步骤(B)中，重组时，痘苗病毒Western Reserve(WR)株和pCB-SIKE质粒在293A细胞中进行重组，细胞转染按照试剂盒(Effectene)说明书进行操作；筛选时，采用黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸作为筛选药物进行重组病毒液的筛查，通过空斑实验分离重组病毒；鉴定时，利用野生型病毒具有完整的TK区而重组病毒却不具有的特征进行PCR鉴定，获得纯化的溶瘤痘苗病毒oncoVV-SIKE。
[001本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒，其特征在于，所述的溶瘤痘苗病毒携带SIKE基因，所述SIKE基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒，其特征在于：其中，所述的溶瘤痘苗病毒为痘苗病毒Western Reserve株、痘苗病毒天坛株、痘苗病毒Wyeth株、痘苗病毒Copenhagen株、痘苗病毒Lister株或痘苗病毒NYCBH株。3.权利要求1或2所述的携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(A)将SIKE的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-SIKE质粒；(B)pCB-SIKE质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得所述携带SIKE基因的溶瘤痘苗病毒。4.根据权利要求3所述的携带SIKE基因的溶瘤痘苗病...

【专利技术属性】
技术研发人员：李恭楚，
申请(专利权)人：杭州功楚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：