一种三联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种三联疫苗，所述三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫La Sota病毒株、灭活的H9亚型禽流感QF01株和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白，还提供其制备方法：I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白经二乙烯亚胺灭活后，与灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液混合乳化后得到三联灭活疫苗。本发明专利技术的三联灭活疫苗灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白含量高，免疫原性强，甲醛和内毒素含量低，对当前流行的I群8b型禽腺病毒具有较好的保护效果，安全性能好，免疫效果确实，可以抵抗新城疫病毒、禽流感病毒以及I群8b型禽腺病毒对临床鸡群的感染，持续期长，仅使用一次0.3mL疫苗的情况下，免疫持续期能达到五个月，至少给鸡群提供70%的保护率。

A triple inactivated vaccine and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种三联灭活疫苗及其制备方法
本专利技术属于疫苗
，具体涉及一种三联灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
新城疫(Newcastledisease,ND)是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害全球养禽业最为严重的烈性传染病之一。OIE将其列为A类疫病，是我国《国家中长期动物疫病防治规划》中规定优先防治和重点防范的5种一类动物疫病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病。禽流感(Avianinfluenza，AI)是由A型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)感染禽类引起的一类传染病，广泛发生于世界各地，并且经常变异，对人类和养禽业危害很大。禽流感H9亚型数与低致病性禽流感，在养殖场的发病率比较高，发病症状不太明显，但对鸡肠道和输卵管等影响非常大。2013年以来，一种高致病性病原在我国多个省份流行，导致大量家禽死亡，主要病变表现为肝脏出血。经鉴定，该病为Ⅰ群禽腺病毒血清8b型感染。对该病进行流行病学调查发现，该病在我国鸡群中发病率较高，尤其对雏鸡致病严重，主要发生于雏鸡，病雏生长受阻、羽毛蓬乱、蹲伏。多于48h内死亡或逐减康复。鸡群发病后会突现3～5d的死亡高峰。死亡率低，可能至10％，个别可达30％。有时病程也可持续2～3d。由于目前临床无批准的禽腺病毒疫苗，禽腺病毒的流行给养殖业带来巨大的损失。鸡新城疫、H9亚型禽流感是严重威胁家禽较为常见的2种重要疾病；同时，I群8b型禽腺病毒对鸡群的感染也给养殖业带来严重的损失。养殖场为减少成本投入和避免对鸡群的注射应激，急需安全高效和便于投放的多联疫苗，来应对不断变化的疫病防控形势。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种三联灭活疫苗，该疫苗内毒素含量低，安全性能好，免疫效果确实，可以抵抗新城疫病毒、禽流感病毒以及I群8b型禽腺病毒对临床鸡群的感染，持续期长，使用三联灭活疫苗仅仅使用一次0.3mL疫苗的情况下，免疫持续期能达到五个月，至少给鸡群提供70％的保护率，该疫苗的制备方法中国使用I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白，是用表达鸡禽腺病毒(I群8b型)Hexon蛋白的重组杆状病毒rHexon株F0代接种Sf9细胞，收获细胞培养物，离心后取上清液制得，与灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液混合后乳化后得到三联灭活疫苗。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种三联灭活疫苗，所述三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫LaSota病毒株、灭活的H9亚型禽流感QF01株和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的核苷酸如SEQIDNO.1所示；所述鸡新城疫LaSota病毒株的含量≥108.5EID50/0.1mL；所述H9亚型禽流感QF01株的含量≥107.5EID50/0.1mL；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白含量的琼扩效价≥1:32；所述H9亚型禽流感QF01株，属于流感病毒，于2019年08月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCCNo.18338。本专利技术还提供了制备上述的三联灭活疫苗的方法，该方法为：S1、I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的制备：S101、pMD-Hexon重组质粒的制备：设计适于杆状病毒表达系统表达Hexon蛋白核酸序列的引物对，分别命名为FAdV-F和FAdV-R，所述FAdV-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述FAdV-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；以提取的I群8b型禽腺病毒DNA为模板，以FAdV-F和FAdV-R为引物，进行PCR扩增，得到Hexon目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收Hexon目的片段，并用T4DNA连接酶连接到pMD-19T载体上，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒a，将重组质粒a在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒a命名为pMD-Hexon重组质粒；所述Hexon目的片段的的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，核苷酸如SEQIDNO.1所示；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；S102、pFastBacI-Hexon中转质粒的制备：用BamHI限制性内切酶和EcoRI限制性内切酶将pFastBacI质粒和S101中得到的pMD-Hexon重组质粒分别进行双酶切，得到pFastBacI酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别回收pFastBacI酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，然后用T4DNA连接酶在温度为4℃的条件下连接12h～14h，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒b，将重组质粒b在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒b命名为pFastBacI-Hexon中转质粒；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；S103、重组杆粒pF-rBac-Hexon的构建：将S102中得到的pFastBacI-Hexon中转质粒转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，得到重组大肠杆菌DH10Bac，得到重组杆粒，将在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑选阳性单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测与预期大小一致后回收，命名为重组杆粒pF-rBac-Hexon；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；S104、重组杆粒转染sf9细胞：用脂质体转染的方法，将S103中得到的重组杆粒pF-rBac-Hexon转染昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到重组杆状病毒rHexon株F0代；S105、重组杆状病毒的扩增：将S104中得到的重组杆状病毒rHexon株F0代接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到F1代重组杆状病毒；S106、I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的获得：将S105中得到的F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三联灭活疫苗，其特征在于，所述三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫LaSota病毒株、灭活的H9亚型禽流感QF01株和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述鸡新城疫La Sota病毒株的含量≥10

【技术特征摘要】
1.一种三联灭活疫苗，其特征在于，所述三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫LaSota病毒株、灭活的H9亚型禽流感QF01株和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的核苷酸如SEQIDNO.1所示；所述鸡新城疫LaSota病毒株的含量≥108.5EID50/0.1mL；所述H9亚型禽流感QF01株的含量≥107.5EID50/0.1mL；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白含量的琼扩效价≥1:32；所述H9亚型禽流感QF01株，属于流感病毒，于2019年08月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCCNo.18338。


2.一种制备如权利要求1所述的三联灭活疫苗的方法，其特征在于，该方法为：
S1、I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的制备：
S101、pMD-Hexon重组质粒的制备：
设计适于杆状病毒表达系统表达Hexon蛋白核酸序列的引物对，分别命名为FAdV-F和FAdV-R，所述FAdV-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述FAdV-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；以提取的I群8b型禽腺病毒DNA为模板，以FAdV-F和FAdV-R为引物，进行PCR扩增，得到Hexon目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收Hexon目的片段，并用T4DNA连接酶连接到pMD-19T载体上，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒a，将重组质粒a在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒a命名为pMD-Hexon重组质粒；所述Hexon目的片段的的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，核苷酸如SEQIDNO.1所示；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
S102、pFastBacI-Hexon中转质粒的制备：
用BamHI限制性内切酶和EcoRI限制性内切酶将pFastBacI质粒和S101中得到的pMD-Hexon重组质粒分别进行双酶切，得到pFastBacI酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别回收pFastBacI酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，然后用T4DNA连接酶在温度为4℃的条件下连接12h～14h，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒b，将重组质粒b在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒b命名为pFastBacI-Hexon中转质粒；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
S103、重组杆粒pF-rBac-Hexon的构建：
将S102中得到的pFastBacI-Hexon中转质粒转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，得到重组大肠杆菌DH10Bac，得到重组杆粒，将在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑选阳性单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测与预期大小一致后回收，命名为重组杆粒pF-rBac-Hexon；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
S104、重组杆粒转染sf9细胞：
用脂质体转染的方法，将S103中得到的重组杆粒pF-rBac-Hex...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贺伟，杨振，董均，杨少宗，李琛，宋敏杰，田文静，郭少阳，张淼丹，程相朝，张春杰，
申请(专利权)人：洛阳职业技术学院，张贺伟，扬州优邦生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41