猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，特别是指一种猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用。所述三联疫苗包括抗原组分和冻干保护剂，其中抗原组分包括猫杯状病毒BJ株灭活抗原、猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原和猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原。本发明专利技术采用全悬浮技术制备的猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒抗原，经灭活、浓缩及冻干等工艺制成猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活冻干疫苗，一针免三病，减少了动物的免疫次数，降低了动物应激次数，大大降低了饲养人的经济成本。

【技术实现步骤摘要】
猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于兽用生物制品
，特别是指一种猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
猫杯状病毒(Felinecalicivirus,FCV)是杯状病毒科杯状病毒属的重要成员之一，可引起猫及猫科动物呼吸道传染病，该病主要侵害6-84日龄幼猫，多发于56-84日龄，1岁以下的猫最易感，日龄越小的猫感染后死亡率越高。其主要临床症状表现为鼻炎、结膜炎、急性口腔溃疡、肺炎、慢性胃炎和跛行等。自1957年Fastier首次分离鉴定FCV以来，在欧洲、美洲、亚洲均发现FCV，其已呈世界性分布。近年来，由于FCV高度的变异性产生的强毒株可引起严重、急性、致死性全身性疾病(VirulentSystemicDisease，VSD)，对猫及猫科动物的健康造成严重威胁。猫传染性鼻气管炎，是由猫疱疹病毒Ⅰ型(Felineherpesvirus1，FHV-1)引起的，在幼猫和成年猫中均可发生。主要表现为发热、眼部及鼻部黏膜损伤和明显上呼吸道感染症状，发病率高达100％，死亡率可达50％，是目前已知最严重的猫呼吸道疾病之一。1957年CrandellR.A于美国首次在患病幼猫体内分离得到FHV-1。随后在越南、荷兰、英国、日本、匈牙利等地分离到此病。之后我国多次检测并分离到该病毒。该病在我国呈上升趋势。猫泛白细胞减少症(Felinepanleukopeniavirus，FPV)，又称猫瘟、猫传染性肠炎病毒。是由猫细小病毒引起的一种急性高度接触性传染病。主要症状为高热、呕吐、腹泻、脱水，循环障碍及白细胞大量减少。该病具有高度传染性，主要感染1岁以内幼猫，发病率和死亡率均很高。1928年Verge首次鉴定出该病毒，之后在加拿大、美国、日本等许多国家都有发现，我国在1984年首次分离到该病毒，之后张振兴和李刚等人报道在河北、河南、浙江等地均有猫细小病毒病的发生。该病在世界上广泛存在，被认为是猫重要的传染病之一。现市面上疫苗生产多采用转瓶或纸片载体生长，因此生产的抗原有限。随着兽用疫苗生产发展自动化、规模化的需求，无载体全悬浮细胞培养技术成为新的发展趋势。生物反应器细胞全悬浮培养技术中，细胞生长不再受载体限制，省掉了载体培养消化等步骤，细胞培养更为简单，更有先行化放大的优选，适于工业化大规模生产。专利CN200810154578.7中公开了猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联疫苗，将已长成90％单层的宿主细胞系分别接种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒，并加入细胞维持液，在37℃下培养；该专利所用的宿主细胞为贴壁细胞，而贴壁细胞生长时间有限，所能制备的抗原也受限，且滴度不稳定，造成疫苗的稳定性差。目前临床上，猫只多发生这三种疾病混合感染，混合感染后症状较重，主要采用注射疫苗进行预防。由于近年来多出现病毒变异株，市面上的疫苗不能很好的起到保护作用，急需新的流行毒株疫苗的产生。而现有用于制备疫苗的毒株毒力弱、抗原TCID50值低，抗原水平低肯定影响疫苗的免疫效果，因为灭活疫苗接种到动物体内后，需要靠抗原来刺激机体产生免疫反应，最终形成抗体，抗原含量不够直接影响免疫反应的强弱，最终导致产生抗体少，水平低。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提出一种猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用。本专利技术从临床发病猫体内分离得到的对猫安全、免疫原性好、病毒增殖稳定的猫杯状病毒、猫传染性性鼻气管炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒三联疫苗株，分别命名为：猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞减少症病毒SY株。本专利技术的技术方案是这样实现的：猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，所述三联疫苗包括抗原组分和冻干保护剂，其中抗原组分包括猫杯状病毒BJ株灭活抗原、猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原和猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原。所述猫杯状病毒BJ株灭活抗原由猫杯状病毒BJ株制备，命名为：猫杯状病毒BJ株，保藏蝙号为：CCTCCNO：V202002，保藏日期为：2020年6月10日。所述猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原由猫传染性鼻气管炎病毒SH株制备，命名为：猫传染性鼻气管炎病毒SH株，保藏蝙号为：CCTCCNO：V202003，保藏日期为：2020年6月10日。所述猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原由猫泛白细胞减少症病毒SY株制备，命名为猫泛白细胞减少症病毒SY株，保藏蝙号为：CCTCCNO：V202004，保藏日期为：2020年6月10日。上述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗的制备方法，步骤如下：(1)分别将猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞减少症病毒SY株接种于悬浮F81S细胞培养液中，培养一段时间后，分别收集三种毒株的毒液即为三种毒株的抗原液；(2)将步骤(1)的三种毒株的抗原液中分别加入灭活剂灭活后，再等比例混匀得混匀液，再加入冻干保护剂冷冻真空干燥即得猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗。所述步骤(1)中的悬浮F81S细胞的培养方法为：①将全悬浮F81S细胞接种于含有2％血清悬浮培养液的专用悬浮培养摇瓶中，在36.5-37.5℃培养60-72h进行扩增，细胞培养液细胞密度不低于5×105个/mL，且细胞活力≥90％，按照1:(3-5)的比例传代放大培养，得F81S细胞悬浮液；②将步骤①培养得到的F81S细胞悬浮液接种入生物反应器中，接种体积为1-2L，补加2％血清悬浮培养液至5L，培养72-96h后的细胞培养液细胞密度不低于2×106个/mL，且细胞活力≥90％；③取步骤②得到的细胞培养液3.5L转移至生物反应器中，补加含2％血清悬浮培养液至10L，继续培养72-96h后，细胞培养液细胞密度不低于2×106个/mL，且细胞活力≥90％。即得到可用作接毒的悬浮F81S细胞培养液。所述步骤(1)中猫杯状病毒BJ株的接毒量为悬浮F81S细胞培养液体积的2-5％，猫传染性鼻气管炎病毒SH株的接毒量为悬浮F81S细胞培养液体积的2-5％，猫泛白细胞减少症病毒SY株的接毒量为悬浮F81S细胞培养液体积的5-15％；猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞减少症病毒SY株的培养时间分别为24-48小时、24-48小时和72-96小时，当细胞活率﹤30％时收获病毒液，收获的毒液于-20℃以下保存。所述步骤(2)中灭活剂为BEI灭活剂，BEI灭活剂为0.4mol/LBEA和0.4mol/LNaOH以体积比1:1比例混合制备，每种毒株的抗原液中加入灭活剂后毒株的终浓度为3mM，灭活时间为36-40小时。所述步骤(2)中冻干保护剂为脱脂奶粉；混匀液与冻干保护剂的体积比为1:(1-5)。上述的三联疫苗在制备联合预防猫杯状病毒病、猫传染性鼻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，其特征在于：所述三联疫苗包括抗原组分和冻干保护剂，其中抗原组分包括猫杯状病毒BJ株灭活抗原、猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原和猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原。/n

【技术特征摘要】
1.猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，其特征在于：所述三联疫苗包括抗原组分和冻干保护剂，其中抗原组分包括猫杯状病毒BJ株灭活抗原、猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原和猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原。


2.根据权利要求1所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，其特征在于：所述猫杯状病毒BJ株灭活抗原由猫杯状病毒BJ株制备，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V202002，分类命名为：猫杯状病毒BJ株，保藏日期为：2020年6月10日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。


3.根据权利要求1所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，其特征在于：所述猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原由猫传染性鼻气管炎病毒SH株制备，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V202003，分类命名为：猫传染性鼻气管炎病毒SH株，保藏日期为：2020年6月10日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。


4.根据权利要求1所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，其特征在于：所述猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原由猫泛白细胞减少症病毒SY株制备，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V202004，分类命名为：猫泛白细胞减少症病毒SY株，保藏日期为：2020年6月10日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。


5.权利要求1-4任一项所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）分别将猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞减少症病毒SY株接种于悬浮F81S细胞培养液中，培养一段时间后，分别收集三种毒株的毒液即为三种毒株的抗原液；
（2）将步骤（1）的三种毒株的抗原液中分别加入灭活剂灭活后，再等比例混匀得混匀液，再加入冻干保护剂冷冻真空干燥即得猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗。


6.根据权利要求5所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗的制备方法，其特征在，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雅君，李少英，徐树兰，
申请(专利权)人：郑州爱科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41