猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用，涉及合成肽疫苗技术领域；包括T细胞辅助表位混合多肽、口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽；所述T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽相串联，所述口蹄疫毒株包括O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒；所述O型口蹄疫病毒包括OZK/93和O/MYA98/BY/2010口蹄疫病毒毒株；所述A型口蹄疫病毒包括A/GDMM/2013口蹄疫病毒毒株。试验表明该二价合成肽疫苗具有生物安全性好，易于大规模合成，可以有效预防目前国内流行的O型及A型猪口蹄疫流行毒株的感染。

【技术实现步骤摘要】
猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用
本专利技术涉及合成肽疫苗
，具体涉及一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种针对流行的猪O型口蹄疫病毒和猪A型口蹄疫病毒具有交叉免疫保护效力的二价合成肽疫苗及其制备方法和与应用。
技术介绍
口蹄疫病毒(FMDV)在偶蹄类动物(包括牛和猪)中引起高度传染性疾病，发病率很高。FMDV可以通过使用化学灭活的全病毒疫苗来控制；但是，一些缺点与灭活疫苗的使用有关。例如，疫苗提供了短期保护，因此需要重新接种，并且在疫苗生产过程中有污染性NS蛋白质被释放的风险，免疫动物除了产生病毒结构蛋白外，还产生了对污染蛋白的抗体反应，这使得用目前认可的诊断试验很难可靠地区分免疫动物与感染或恢复期动物。因此，一些拥有大型畜牧业的国家已经放弃了疫苗接种。但这一政策使得畜群容易突然爆发口蹄疫，对牲畜养殖和国家民生经济产生巨大影响，正如2001年英国所见反过来导致了对替代疫苗接种策略的深入研究。FMD病毒颗粒由一个正链RNA基因组、一个编码四种衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的开放阅读框(ORF)和十一种不同的成熟非结构蛋白(NSP)组成。多肽疫苗是一种依靠短肽片段来设计高靶向诱导免疫反应，从而避免过敏或反应性序列。位于FMDVVP1蛋白G-H环(约129-169残基)中的B细胞结合位点被鉴定为一个主要表位，可在自然宿主和动物模型中诱导对该病毒的中和抗体,各种基于FMDVVP1G-H环的合成肽或重组蛋白疫苗在猪中已显示出有效性。上述策略为接种的动物提供了有限的病毒免疫原子集，尽管它们经常诱导中和抗体的高滴度，但它们并不总能在家畜中实现对病毒挑战的保护，主要原因是并非所有宿主物种可以识别这些表位。所以一种有效的多肽疫苗需要一个B细胞表位来激发高中和抗体反应，需要一个T细胞表位来提供T细胞和B淋巴细胞之间的充分合作。那么诱导保护性免疫的另一机制即刺激表位特异性T细胞就显得尤为重要。在感染性疾病的情况下，T细胞的募集可导致病原体本身或受感染宿主细胞的迅速破坏和清除，从而阻止感染的传播。通用的辅助性T细胞表位，可与表位肽或蛋白质序列串联融合以刺激抗体反应，从而对关键中和表位更集中的免疫反应。本专利技术采用的T细胞辅助多肽表位来源于高抗原性麻疹病毒融合蛋白(MVF288-302)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg19-33)，并进行了组合突变进行了优化，并在不同的遗传背景下进行了广泛的反应性筛选显示出良好的免疫原性。所以通过T细胞表位来提供T细胞和B淋巴细胞之间的充分合作形成的合成肽是特别有吸引力的FMDV疫苗候选，它们是高度纯净，结构明确，稳定和使用安全，并且由于它们可以模块化方法制备，并且可以合并融合不同的T细胞辅助多肽。FMDV具有A型、O型、C型、Asia1型、SAT1型、SAT2型和SAT3型七种不同的血清型，并且每一种血清型之间没有交叉保护作用，口蹄疫病毒极易发生变异，一次口蹄疫暴发其病毒估计有50～100个位置的核苷酸发生突变，如果在免疫压力下其发生变异的频度会更高，并可能发生主要抗原位点变异而导致病毒抗原性的改变，从而使交叉保护不完全，即同型疫苗不能对同一血清型的某些毒株起到保护作用。目前在我国牲畜养殖种主要存在A型和O型二种血清型的流行。公开号为CN108273054A的中国专利技术专利公开了一种即对血清型O型又对血清型A有防治作用的疫苗，其利用免疫球蛋白Fc基因功能区展示抗原表位，通过原核表达系统表达重组蛋白形成疫苗免疫动物，但其存在着一些难于克服的缺点，如表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害，同时过量表达可能导致非生理反应，并且目的抗原常以包涵体形式表达，导致后续产物纯化困难；表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性一般较低，这也使得专利中表达出的多肽用量较高在100ug-200ug/头份。
技术实现思路
为解决现有技术中的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种针对流行的猪血清O型口蹄疫病毒和猪血清A型口蹄疫病毒具有交叉免疫保护效力的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法和与应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，包括T细胞辅助表位混合多肽、口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽；所述T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽相串联。所述T细胞辅助表位混合多肽、口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽是通过化学合成方法得到；所述T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽通过化学合成方法相串联；所述合成肽疫苗还包括免疫佐剂，T细胞辅助表位混合多肽、B细胞抗原表位串联多肽与免疫佐剂混合形成油包水或水包油包水乳液疫苗；优选的，免疫油佐剂选择SEPPIC公司的ISA50V形成油包水乳液疫苗；优选的，免疫油佐剂选择SEPPIC公司的ISA206形成水包油包水乳液疫苗。优选的，所述串联的方法具体包括将T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽通过至少一个赖氨酸相连接；更加优选的，赖氨酸含有两个氨基(ɑ-氨基和ε-氨基)，所述串联的方法具体为将T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽通过ε-N-赖氨酸或ε-N-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸相连接，ε-N-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸代表N-末端的赖氨酸再连接其它分子时是连接在ε-氨基上。优选的，所述T细胞辅助表位混合多肽的T细胞辅助表位来源于高抗原性麻疹病毒融合蛋白(MVF288-302)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg19-33)，并经过人工组合突变改造优化所得。所述人工组合突变改造优化的方法具体为：通过串联外源“混杂性”Th表位可有效增强或刺激机体对其免疫应答能力，这与生物广泛趋异进化的MHC基因型有关；像这类表位通常具有T细胞表位的共性特征，如Berzofsky认为的具有两性α螺旋二级结构共性，其中疏水性氨基酸占据螺旋一面，带电荷残基和极性氨基酸占周围面，这类结构在亲水环境中，疏水性残基有助于α螺旋形成；Rothbard等分析比较了一些已知的T细胞表位序列的一级结构，得出MHC-Ⅱ类分子与抗原肽结合位点的氨基酸共有的模式特征Rothbard规则。这些规则和共性都有助于构建人造通用Th表位，根据这些规则构建的Th2表位已成功用于猪口蹄疫O型合成肽疫苗，根据这类规则构建Th1表位。T细胞表位特异性由T细胞受体(TCR)介导，TCR将I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)的“肽结合沟”中的肽与抗原提呈细胞(APC)结合。整个抗原被APCs内化并蛋白水解，然后短肽(I类为8-11个残基，II类为11-30个残基)被装载到MHC(或HLA)中并呈现在APC表面。然后肽表位特异性的TCR去结合那些肽-MHC复合物(pMHCs或pHLA)，T细胞/APC界面上的各种蛋白质协调T细胞克隆的扩展。通常I类MHC中呈现的肽通常较短；设计的肽遵循X-(L/I)-X(6-7)-(V/L)的序列模式，其中，L/I和V/L代本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，包括T细胞辅助表位混合多肽、口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽；所述T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽相串联。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，包括T细胞辅助表位混合多肽、口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽；所述T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽相串联。


2.根据权利要求1所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述串联的方法具体包括将T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽通过至少一个赖氨酸相连接。


3.根据权利要求1所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述T细胞辅助表位混合多肽的T细胞辅助表位来源于高抗原性麻疹病毒融合蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原，并经过人工组合突变改造优化所得。


4.根据权利要求3所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述T细胞辅助表位混合多肽包括Th1、Th2、Th3中的一种；
Th1的序列为：GILES/T(1:1)R/K(1:1)GIK/R(1:1)AR/K(1:1)IT/G(1:1)H/R(1:1)TELIF；
Th2的序列为：ISIS/T(1:1)EIG/R(1:1)K/T(1:1)VIVK/R(1:1)H/T(1:1)IEG/T(1:1)IFLL；
Th3的序列为LSEIKGVIVHRLEGV。


5.根据权利要求1所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述口蹄疫毒株包括O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒；
所述O型口蹄疫病毒包括OZK/93和O/MYA98/BY/2010口蹄疫病毒毒株；所述A型口蹄疫病毒包括A/GDMM/2013口蹄疫病毒毒株。


6.根据权利要求5所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述OZK/93相关的B细胞抗原表位序列为VYNGSCKYSDARVSNVRGDLQVLAQKAERCLPTSFNYGAIK；所述OZK/93相关的B细胞抗原表位序列的158位C与134位C形成二硫键，通过两个半胱氨酸形成环状结构。


7.根据权利要求5所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述O/MYA98/BY/2010相关的B细胞抗原表位序列为VYNGNCKYAGGSLT...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬明放，张震，石海芳，杜祥月，
申请(专利权)人：申联生物医药上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31