一种细胞纯悬浮工艺生产猪圆环病毒2型（PCV2）的方法技术

一种细胞纯悬浮工艺生产猪圆环病毒2型的方法，它使用无血清、无微载体的悬浮培养基，并包括如下步骤：(1)细胞准备：在摇瓶中培养PK15细胞；(2)细胞放大培养：将复苏的细胞接种到生物反应器中逐级放大培养；(3)病毒接种：将PCV2病毒接种于反应器内，继续培养细胞；(4)病毒收获。其中步骤(1)‑(3)中所述的培养，其pH值维持在6.8‑7.4，其培养温度为37℃；步骤(2)所述的逐级放大培养，其传代后初始细胞密度为0.8×10

A cell suspension method for PCV2 production

【技术实现步骤摘要】
一种细胞纯悬浮工艺生产猪圆环病毒2型（PCV2）的方法
本专利技术涉及细胞工程领域，具体涉及一种基于PK15细胞生产猪圆环病毒2型的方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(PorcineCircovirusType2，PCV2)感染是目前国内养殖场普遍存在的现象，由于该病毒的感染会导致免疫抑制并诱发其他疾病的发生，给养猪业带来巨大的经济损失，因此圆环病毒相关性疾病的防控面临着严峻的形势。疫苗免疫仍是目前防控猪圆环病毒2型感染的主要措施之一。将PCV2灭活制成的全病毒灭活疫苗由于其含有完整的病毒颗粒，具有较好的免疫效果，仍是目前市场上的主流产品。借助猪肾细胞PK15悬浮培养、再接种PCV2于前述细胞，来生产PCV2，是目前PCV2生产的主流技术发展方向。目前有很多疫苗生产企业采用细胞微载体悬浮培养技术进行圆环病毒2型病毒液的制备，可以获得较高的病毒滴度；但该工艺由于使用了细胞微载体、且需要血清和D-氨基葡萄糖等成分来提高病毒效价，导致原料和分离成本较高。专利CN108103003A公开了一种不带细胞微载体的悬浮培养技术，只能在2L培养体系中使得PK15细胞浓度超过微载体悬浮培养。但该技术的培养体系太小，不足以达到产业化要求。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种细胞纯悬浮工艺生产猪圆环病毒2型的方法，它是使用无血清悬浮培养基，并包括如下步骤：(1)细胞准备：在摇瓶中培养PK15细胞，pH值维持在6.8-7.4；(2)细胞放大培养：将复苏的细胞接种到生物反应器中逐级放大培养，其pH值维持在6.8-7.4；(3)病毒接种：将PCV2病毒接种于反应器内，继续培养细胞，其pH值维持在6.8-7.4；(4)病毒收获；步骤(2)所述的逐级放大培养，其传代后初始细胞密度为0.8×106-1×106个/mL；进一步地，所述无血清悬浮培养基为上海奥浦迈生物科技有限公司生产的OPM-PK15SFMl培养基。如前所述的方法，步骤(1)的摇瓶容积为100-250mL。如前所述的方法，步骤(2)的生物反应器包括1L、7L、85L和500L的至少两种。如前所述的方法，步骤(2)的1L生物反应器培养条件为：搅拌速度为110-140rpm，优选为120rpm；溶氧量为30-50％，优选40％；通气方式为大泡通气；通气量为0.8-1.0L/h，优选1.0L/h。如前所述的方法，步骤(2)的7L生物反应器培养条件为：搅拌速度为30-100rpm，优选为70-80rpm；通气方式为大泡通气；通气量为0.4-3L/h，优选6-12L/h。如前所述的方法，步骤(2)的85L生物反应器培养条件为：搅拌速度为25-60rpm，优选为25-50rpm；通气方式为大泡通气；通气量为3-7L/h，优选4.8-6L。如前所述的方法，步骤(3)的病毒接种时，初始感染复数为0.02。如前所述的方法，步骤(4)的病毒收获是：接毒后每72h对PK15细胞传代一次，每传代一次则收获部分细胞，剩下的细胞用无血清悬浮培养基稀释至1×106cells/ml继续培养、传代，传代时仍然收获部分细胞，剩下的细胞用无血清悬浮培养基稀释至1×106cells/ml继续培养、传代......如此循环，直到继续培养至细胞活力＜70％，将所有培养物收获。另外，步骤(4)的病毒收获还可以是：接毒后每24小时取样收获细胞培养物，待细胞活力＜70％时，将所有培养物一起收获。本专利技术的技术方案避免了血清和微载体的使用，节约了原料成本，还能降低病毒的纯化成本。另一方面，本专利技术的技术方案还能获得很高的病毒滴度，1g(TCID50/mL)的值最高可以达到7.83，而目前近似体量的微载体悬浮培养PK15细胞生产PCV2最高能达到8.0，说明本专利技术的方法在不使用微载体和血清的情况下，还能达到与微载体培养方法相当的病毒滴度，效果是难以预料的。本专利技术还具有生产周期短的优点，仅312小时，就可以从85L生物反应器中收获病毒。综上，本专利技术的在PCV2的生产上具有很好的商业价值。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1为细胞在生物反应器上的扩增路线示意图具体实施方式实施例1PK15细胞悬浮培养细胞先在摇瓶中活化，然后经过生物反应器逐级扩增培养，扩增路线如图1所示。具体的，分如下步骤进行：1.细胞准备将复苏后的PK15细胞置于3个250mL摇瓶中，培养培养条件37℃，5％CO2，130rpm，培养3-4天后对细胞取样计数，根据计数的结果来判定传代比例，传代后初始细胞密度应维持在(0.8-1)×106cells/mL。2.PK15细胞在1L生物反应器中放大将细胞密度调整到8×105cells/mL，转入1L生物反应器中进行培养，培养体积为800mL，培养条件为：溶氧40％，pH7.2，转速130rpm，温度37℃，通气控制在0.8-1.0L/h。培养72h细胞密度增长至3.2×106cells/mL，细胞活力93％，96h后细胞密度达到4.8×106cells/mL，细胞活力93.6％。3.PK15细胞在7L生物反应器中放大将1L生物反应器中的细胞按照1×106cells/mL的细胞密度进行扩增，扩增后细胞体积为4L，并转入7L生物反应器进行培养。设置培养条件为：pH7.2，搅拌器转速80rpm，溶氧量40％，通气方式为大泡通气，通气量10-20mL/min。细胞培养96h后细胞密度达到3.6×106cells/mL，细胞活力91.6％。将细胞培养体积扩大到5L，培养48h后测定细胞密度为4.2×106cells/mL，活力为92％。4.PK15细胞在85L生物反应器中放大将细胞进行传代，并扩增培养体积至20L，细胞密度为1×106cells/ml，转入85L生物反应器中进行培养。培养条件为溶氧40％，pH7.2，转速50rpm，温度37℃，通气控制在80-100mL/min，并根据pH的变化不断的补入新鲜培养基。培养72h后，取样测定细胞密度为3.4×106cells/mL，细胞活力92.1％。补入新鲜培养基，调整细胞密度至1×106cells/mL，细胞培养体积扩大到60L。实施例2细胞接毒及传代收获将PCV2细胞毒按照0.02MOI(MOI，multiplicityofinfection，感染复数)接种到生物反应器中，接毒后每72h对PK15细胞传代一次，即取样测定细胞活力和密度后，将满足细胞稀释后密度为1×106ce本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞纯悬浮工艺生产猪圆环病毒2型的方法，其特征在于：它是使用无血清悬浮培养基，并包括如下步骤：/n(1)细胞准备：在摇瓶中培养PK15细胞，pH值维持在6.8-7.4；/n(2)细胞放大培养：将复苏的细胞接种到生物反应器中逐级放大培养，其pH值维持在6.8-7.4；/n(3)病毒接种：将PCV2病毒接种于反应器内，继续培养细胞，其pH值维持在6.8-7.4；/n(4)病毒收获；/n步骤(2)所述的逐级放大培养，其传代后初始细胞密度为0.8×10

【技术特征摘要】
1.一种细胞纯悬浮工艺生产猪圆环病毒2型的方法，其特征在于：它是使用无血清悬浮培养基，并包括如下步骤：
(1)细胞准备：在摇瓶中培养PK15细胞，pH值维持在6.8-7.4；
(2)细胞放大培养：将复苏的细胞接种到生物反应器中逐级放大培养，其pH值维持在6.8-7.4；
(3)病毒接种：将PCV2病毒接种于反应器内，继续培养细胞，其pH值维持在6.8-7.4；
(4)病毒收获；
步骤(2)所述的逐级放大培养，其传代后初始细胞密度为0.8×106-1×106个/mL。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述无血清悬浮培养基为上海奥浦迈生物科技有限公司生产的OPM-PK15SFM1培养基。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)的摇瓶容积为100-250mL。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)的生物反应器包括1L、7L、85L和500L的至少两种。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)的1L生物反应器培养条件为：搅拌速度为110-140rpm，优选为120rpm；溶氧量为30-50％，优选40％；通气方式为大泡通气；通气量为0.8-1.0L/h，优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢刚，岳丰雄，魏胜男，方芳，黄杰，刘立新，王洁清，李晏齐，徐祥兰，廖鳌，刘俊，王燕，
申请(专利权)人：成都天邦生物制品有限公司，马鞍山史记动物健康管理有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51