一种黏附型细胞支架及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种以果胶为基础材料的细胞黏附型支架的制备方法及其应用。其特征在于以果胶为初原料，通过接枝改性的方法制备得到细胞黏附性果胶，将细胞、微生物等生物活性物质与壁材混合后逐滴加入固化液中，固化形成载生物活性物质支架。所述方法制备工艺简便，过程绿色环保；所得支架细胞黏附性强，内部孔隙大，利于细胞的黏附及成团生长。这种黏附性高分子支架可用于细胞培养、组织修复、药物筛选、药物安全性评价等方面。

An adherent cell scaffold and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种黏附型细胞支架及其制备和应用
本专利技术涉及生物工程及生物医药领域，具体地说是一种以改性果胶为基质载体的高黏附性细胞支架，该支架可用于细胞、微生物等生物活性物质的培养或包埋，该方法工艺简便，细胞黏附性好、内部孔隙率大，生物活性好，可实现高密度、高活性培养。研究背景果胶是一种广泛存在于陆生高等植物细胞壁中的杂多糖，其分子质量5-40万之间。果胶具有良好的生物相容性，是FAO/WHO推荐的不受添加量限制的食品添加剂，常用作增稠剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂以及食品保鲜材料等。此外，在生物医药领域，果胶还可用作靶向制剂、基因载体等载体材料。近年来，由于果胶所具有的成凝胶性能，其应用扩展至组织工程领域。与现有应用最为广泛的天然多糖材料——海藻酸相比，果胶与钙离子具有更多的结合位点和更强的化学结合力，因此所成凝胶具有更好的化学及结构稳定性，更适合细胞及活性物质的包埋(Journalofappliedpolymerscience,135(2018):45685(1—9))。细胞黏附是细胞与载体材料间产生的第一步相应，影响后续细胞的铺展、迁移、分化、凋亡等生物学行为。普通水凝胶，无论天然多糖类或合成高分子制备所得，由于缺乏适宜的细胞/基质贴附界面及亲和位点，贴壁细胞的黏附与铺展均到不同程度的限制，影响了装载细胞的活性(Biomaterials,35(2014)4636–4645)。通过在材料中引入黏附位点，提高凝胶材料与细胞的亲和力，是促进细胞与凝胶基质间的黏附及提高水凝胶微反应器内细胞活性的有效手段(J.Biomed.Mater.Res,39(1998)266–276)。F.Munarin等采用接枝修饰果胶，制备出用于软骨再生及组织修复的果胶钙水凝胶注射剂。结果表明改性果胶可有效增强水凝胶体系与细胞黏附性，细胞的生物活性与增殖得到提高(Biomacromolecules,12(2011)568–577)。因此，为解决现有天然果胶在组织工程应用中存在的问题，提高载体支架材料与细胞间作用，从而进一步提高装载细胞及生物活性物质的活性及稳定性，本专利技术开发了一种黏附型细胞支架的制备方法及应用。该方法通过接枝改性的方法提高果胶材料表面氨基数量，增加了材料与细胞间的相互作用位点及分子间作用力，从而提高材料与细胞间的黏附作用力。该方法制备工艺简便，过程绿色环保，可提高材料和装载细胞间的相互作用力，有效提高装载细胞的活性。
技术实现思路
针对目前常用天然高分子载体材料与细胞间相互作用力较弱的问题，本专利技术提供了一种以果胶为初原料，通过接枝改性的方法，提高载体材料与装载物之间的相互作用力，并最终提高装载物活性的方法。为实现上述目的，本专利技术选用果胶为初原料，通过接枝改性的方法，制备高包埋活细胞或其他生物活性物质，所述方法包括以下步骤：(1)称取果胶粉末溶于蒸馏水中，过夜溶胀，搅拌至完全溶解；(2)加入乙二胺，将pH调节为5.3～5.6，充分搅拌至互溶；(3)加入过量的碳二亚胺(EDC)至步骤(2)制得的混合溶液中，搅拌充分反应；(4)将步骤(3)溶液移入透析袋中，蒸馏水透析除去未反应的过量氨基；(5)将步骤(4)中制得的溶液干燥，得改性果胶；(6)将步骤(5)中制得的改性果胶原料溶液生理盐水中，搅拌至完全溶解后无菌过滤。(7)将步骤(6)所得混悬液注入模具中，经固化交联后即得黏附型支架。上述步骤(1)果胶为来源于苹果、柑橘、火龙果、甜菜、向日葵、柚子等中的一种或二种以上高等植物细胞壁的提取物，其分子量在10kDa～400kDa，酯化度DE为50％以下。上述步骤(1)制得的果胶溶液质量浓度为1％～5％，所述步骤(2)中加入的乙二胺，使得混合溶液中—COOH:—NH摩尔比为1:50～1:100。上述步骤(3)中EDC的加入量为果胶：EDC摩尔比＝1:1.5～1:10，反应时间为24～36h。果胶的摩尔数是以果胶主链上的重复结构单元的摩尔数计。上述步骤(4)中透析袋的截留分子量为3000～20000，透析时间为24～36h，每8h更换一次蒸馏水。上述步骤(5)中制得的改性果胶溶液的质量浓度为1.5％～6％。上述步骤(6)中固化液为二价金属钙盐、钡盐或锌盐等中的一种或二种以上的水溶液，浓度为280～320mmol/L。上述步骤(6)中固化温度为20～25度条件，固化液与改性果胶溶液的体积比例为：1:2～1:20。上述黏附型支架适用于细胞，微生物等生物活性物质的包埋和/或培养。上述的细胞为人或哺乳动物来源的肝细胞、骨髓间充质细胞、成骨细胞等生物活性物质功能细胞，各种细胞系细胞：如HepG2细胞、hiPSC细胞、MC3T3细胞等，以及干细胞或干细胞分化的各种细胞中的一种或二种以上；所述微生物包括：酵母菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌等为微生物中的一种或二种以上。本专利技术具有以下优点：1.果胶接枝改性过程中反应条件温和过程简便，制备得到的氨基化果胶，增加了材料与细胞的结合位点，有效提高材料与细胞黏附力；2.接枝改性后的氨基化果胶，生物相容性好，可用于细胞及其他物质的培养；3.改性果胶钙可实现细胞、微生物等活性物质的包埋和/或培养，长时间培养活性良好。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做详细的说明。以下实例将有助于本领域技术及研究人员进一步理解本专利技术，但不构成对本专利技术的任何限制。任何人在本专利技术权利要求范围内所做的任何形式的修改，仍在本专利技术权利要求保护范围之内。实施例1(1)将2g柑橘果胶粉末(分子量120kDa，DE＝36％)溶于100ml去离子水中，充分溶胀后搅拌至完全溶解。(2)将20mL乙二胺加入果胶溶液中(—COOH/—NH2＝1:100)，NaOH调节pH值至5.5，搅拌1～2h至完全溶解。(3)量取5mLEDC(—COOH/EDC＝1:5)，缓慢加入上述混合溶液中，室温下搅拌24～36h。(4)透析清洗反应后的溶液(截留分子量10,000)，清洗48h，每8h更换清洗液。(5)冷冻干燥清洗后的溶液，得到接枝改性的氨基化柑橘果胶。(6)称取0.4g改性果胶粉末，溶于10mL蒸馏水中，过夜搅拌，制得4％(w/v)改性果胶溶液，0.22μm滤膜无菌过滤。(7)将1×107的肝癌细胞HepG2与10mL无菌改性果胶溶液混合均匀，将混合悬液移入10mL注射器中，选用22号针头，使用注射器泵滴入100mL320mM氯化钙溶液中，室温下固化30min，制备出载HepG2改性果胶钙微球。(8)弃去固化液，无菌无血清培养基清洗后收集，加含10％胎牛血清的MEM培养基，隔天换液。与未改性果胶钙凝胶微球相比，改性果胶钙凝胶微球中细胞更易聚集成团，培养1周后细胞团显著增大，活性良好。实施例2(1)将4g苹果果胶粉末(分子量200kDa，DE＝28％)溶于100mL去离子水中，充分溶胀本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以果胶为基础材料的细胞黏附性支架的制备方法，其特征在于：依次包括如下步骤：/n(1)称取果胶粉末溶于水中，搅拌至完全溶解；/n(2)加入乙二胺，充分搅拌至互溶；/n(3)加入过量的碳二亚胺(EDC)至步骤(2)制得的混合溶液中，搅拌充分反应；/n(4)将步骤(3)溶液移入透析袋中，水透析除去未反应的过量氨基；/n(5)将步骤(4)中制得的溶液干燥，得改性果胶；/n(6)将步骤(5)中制得的改性果胶原料溶液生理盐水中，搅拌至完全溶解后无菌过滤；/n(7)将步骤(6)所得混悬液注入模具中，经固化交联后即得黏附型支架。/n

【技术特征摘要】
1.一种以果胶为基础材料的细胞黏附性支架的制备方法，其特征在于：依次包括如下步骤：
(1)称取果胶粉末溶于水中，搅拌至完全溶解；
(2)加入乙二胺，充分搅拌至互溶；
(3)加入过量的碳二亚胺(EDC)至步骤(2)制得的混合溶液中，搅拌充分反应；
(4)将步骤(3)溶液移入透析袋中，水透析除去未反应的过量氨基；
(5)将步骤(4)中制得的溶液干燥，得改性果胶；
(6)将步骤(5)中制得的改性果胶原料溶液生理盐水中，搅拌至完全溶解后无菌过滤；
(7)将步骤(6)所得混悬液注入模具中，经固化交联后即得黏附型支架。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)果胶为来源于苹果、柑橘、火龙果、甜菜、向日葵、柚子等中的一种或二种以上高等植物细胞壁的提取物，其分子量在10kDa～400kDa，酯化度DE为50％以下。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)制得的果胶溶液质量浓度为1％～5％，所述步骤(2)中加入的乙二胺，使得混合溶液中—COOH:—NH摩尔比为1:50～1:100。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中EDC的加入量为果胶：EDC摩尔比＝1:1.5～1:10，反应时间为24～36h。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：孙广炜，赵姗，张英，刘洋，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21