人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体为一种人胚肾上皮细胞293T‑Clone3单克隆细胞株及其应用。本发明专利技术的单克隆细胞株细胞株保藏号为：CCTCC NO：C2019262，具有高的转染效率，转染效率高于商品化的AAV293，转染效率均达到90％以上，每个150mm皿包装的AAV的上清与细胞的总病毒基因拷贝数均在10

【技术实现步骤摘要】
人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用
本专利技术涉及单克隆细胞株
，具体为一种人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用。
技术介绍
基因治疗是以改变人的遗传物质为基础，将外源正常基因或有治疗作用的基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的。而AAV具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达时间长等优势，同时AAV具有多种血清型，而不同血清型的衣壳蛋白识别细胞表面的受体不同，因而在不同组织中的侵染效率不同，可实现对特定细胞类型的高效转导。因此AAV已经被广泛应用于基础研究和临床试验中，成为最常用的基因治疗载体之一。AAV包装系统包括载体质粒、包装质粒和辅助质粒，以及能够能产生病毒颗粒的包装细胞。携带有外源基因的载体质粒在包装质粒、辅助质粒和包装细胞的辅助下，经过病毒包装产生有感染能力的病毒颗粒，收集并纯化后可直接用于感染目的细胞，通过整合到细胞基因组而实现外源基因的的稳定表达。由于现有AAV生产所用的包装细胞系一般从ATCC(美国模式菌种收集中心)处获得，直接使用或者再次经过其他改造后使用，但所使用的细胞仍然是具有异质性的一群细胞组成的细胞系，也即是由具有不同AAV包装效率的一群细胞组成，因而可能会导致整体的AAV生产效率不高，而用于临床治疗需要足够数量即高滴度的AAV。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术提供了一种可提高AAV包装效率、包装病毒滴度高的单克隆细胞株，并在GMP条件下建立了三级细胞库。本专利技术提供的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株，保藏号为：CCTCCNO：C2019262，以下或称为293T-C3细胞，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；邮编：430072；培养物名称：人胚肾上皮细胞293T-Clone3，保藏日期为：2019.11.13。该293T-C3细胞属于人胚肾上皮细胞，培养方法：在DMEM(GIBCO，货号11965-084)培养基中加入10％胎牛血清(BiologicalIndustries，货号04-001-1ACS)，在37℃，体积分数5％的CO2条件下培养。保存条件：气相液氮(-196℃)下保存。上述293T-C3细胞的获得方法，包括如下步骤：1、将从ATCC购买293T细胞进行培养，然后经过细胞消化程序将其分散成单个细胞，利用细胞培养基将细胞稀释(稀释比例以96孔板的每个孔最多含1个细胞为准)后加入到96孔板中进行培养；挑选孔内仅有单个细胞的进行扩大培养，培养数周后形成单克隆细胞株。2、用获得的单克隆细胞株分别包装不同AAV血清型，并测定包装效率、病毒滴度和感染靶细胞效率，得到转染效率以及包装病毒滴度最高的单克隆细胞株。所得到的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株可用于包装病毒。进一步的，上述人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株可用于包装腺相关病毒。进一步的，上述应用包括如下步骤：将人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株在150mm皿中铺板，然后将AAV包装质粒、辅助质粒和表达质粒按摩尔比1:1:1混合，得到混合质粒，再用PEI转染试剂将混合质粒共转染至293T-Clone3单克隆细胞，PEI转染试剂与混合质粒的质量比为1：2，进行培养，培养至72小时后收获上清和细胞。进一步的，所述AAV包装质粒为pAAV1、pAAV2、pAAV3、pAAV5、pAAV6和pDG8质粒。进一步的，所述辅助质粒为pHelper质粒。进一步的，所述表达质粒为pAAV-CB-EGFP质粒。3、建立该单克隆细胞的三级细胞库并进行质检将获得的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株扩大培养，冻存足够数量的细胞，保存为主细胞库；然后从主细胞库中任取一支，继续扩大培养，再次冻存足够数量的细胞，保存为工作细胞库。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：相比于现有技术，本专利技术筛选出的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株对不同血清型AAV转染效率均达到90％以上，而AAV293细胞的包装效率为75-80％，且转染后细胞状态变差。每个150mm皿包装出来的病毒滴度可以达到1011以上，相较于AAV293细胞包装效率至少提高2倍，有的甚至达到40倍。附图说明图1为实施例1获得293T-C3细胞的流程图。图2：A为293T-C3细胞包装的AAV1血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，B为A为293T-C3细胞包装的AAV1血清型病毒转染48h后的细胞流式图；C为AAV293细胞包装的AAV1血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，D为AAV293细胞包装的AAV1血清型病毒转染48h后的细胞流式图。图3：A为293T-C3细胞包装的AAV2血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，B为A为293T-C3细胞包装的AAV2血清型病毒转染48h后的细胞流式图；C为AAV293细胞包装的AAV2血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，D为AAV293细胞包装的AAV2血清型病毒转染48h后的细胞流式图。图4：A为293T-C3细胞包装的AAV3血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，B为A为293T-C3细胞包装的AAV3血清型病毒转染48h后的细胞流式图；C为AAV293细胞包装的AAV3血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，D为AAV293细胞包装的AAV3血清型病毒转染48h后的细胞流式图。图5为实施例3中三级细胞库建立流程图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株的获得(1)将从ATCC购买的293T细胞进行培养，待长满时，分至多个细胞培养瓶进行培养。(2)待其中一瓶细胞密度约70-80％时，弃上清，用PBS洗一遍，然后加入适量胰酶消化液在培养箱中进行消化处理，将其分散成单个细胞。(3)在显微镜下观察消化至单个细胞后，加入完全培养基终止消化，然后1000rpm离心5min。(4)弃上清，用完全培养基重悬细胞并用台盼蓝计数。(5)利用细胞培养基将细胞稀释(稀释比例以96孔板的每个孔至多含1个细胞为准)后加入到96孔板中进行培养；(6)第二天在显微镜下观察96孔板，将含有1个细胞的孔做标记；待做标记的细胞在孔内长满后，将其扩大培养至细胞培养瓶。(7)将扩大的细胞进行冻存保种。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株，其特征在于，保藏编号为：CCTCC NO：C2019262。/n

【技术特征摘要】
1.人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株，其特征在于，保藏编号为：CCTCCNO：C2019262。


2.如权利要求1所述的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株在包装病毒中的应用。


3.如权利要求2所述的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株在包装病毒中的应用，其特征在于，所述病毒选自：腺相关病毒。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株在150mm皿中铺板，然后将AAV包装质粒、辅助质粒和表达质粒按摩尔比1:...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志民，连雪琪，钟晶晶，赵晓燕，褚涌超，卢双双，秦斌，张成林，王尧河，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41