一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液技术

本发明专利技术提供了一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液，包括黑素细胞从表皮的分离培养及冻存方法。本发明专利技术采用分散酶消化，所获得的黑素细胞具有良好的增殖能力、优良的黑色素表达能力。黑素细胞冻存液主要包括黑素细胞完全培养基、胎牛血清、二甲基亚砜，采用梯度冻存方法。该方法可用于培养增殖能力、迁移能力和黑素合成能力强的表皮黑素细胞，可以使患者的黑素细胞在体外更好的生长及分化，可用于临床白癜风或色素减退患者治疗及其相关研究。

Isolation, culture and cryopreservation of epidermal melanocytes based on clinical application

【技术实现步骤摘要】
一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液
本专利技术涉及细胞体外培养技术，具体是一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法黑素细胞的冻存液。
技术介绍
传统的白癜风治疗手段包括药物治疗、紫外线照射、外科手术治疗，目前自体黑素细胞移植成为白癜风治疗的研究和发展方向之一，但需要短时间内在体外大量扩增提高纯度的黑素细胞。为此，很多适合黑素细胞生长的培养基和纯化方法被报道，包括使用高浓度的胎牛血清培养基促进细胞生长。冷冻保存在细胞的短期和长期保存中起着重要作用，对组织和细胞建库具有十分重要的意义。利用库存组织的基于细胞的治疗也越来越多地被用于再生医学的其他领域，借助冷冻保存技术，种子细胞可通过细胞库而及时提供，对临床研究及应用意义重大。冷冻保存降低了研发周期及成本，使得需要的种子细胞在严密监控的条件下进行生产和保存，且复苏后不影响其性能。通常在冻存后由于冻存液的配方及冻存方法不合适，黑素细胞的活性及增值能力大大降低，严重影响其色素修复效果。细胞冻存除了报道添加冷冻剂外，也有文献增加细胞载体，一方面要考虑细胞载体厚度超过150um，有足够的机械稳定性使得在解冻后可控地将构建体转移进入机体中。另一方面要求细胞在合成的细胞载体中不发生整合，或仅在有限的程度上可能发生。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于黑素细胞的分离培养包括以下步骤：1).用PBS清洗表皮组织，医用酒精浸泡，PBS中含有或不含有双抗；2).酒精浸泡好的表皮组织转入装有PBS的培养皿中，清洗数次后剪去皮下组织；3).将处理好的皮肤组织用PBS清洗后，用消化酶消化，将皮肤组织修剪成一定大小的组织块；4).分离的表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶消化；5).在步骤4)消化后的组织中加入培养基，吹打获得细胞悬液，过滤，PBS清洗，离心，黑素细胞培养基为黑素细胞基础培养基加生长因子；6).适量黑素细胞培养基重悬细胞后，置于生化培养箱继续培养；7).黑素细胞贴壁至50-80％融合时，用胰蛋白酶消化提纯黑素细胞；8).适量黑素细胞培养基重悬黑素细胞后离心，PBS清洗后再次离心。9).黑素细胞培养基重悬黑素细胞后接种到培养瓶中；黑素细胞的冻存液配方中包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清；黑素细胞的冻存包括以下步骤：10).待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化；11).将收集的黑素细胞进行离心，PBS重悬清洗后再次离心收集黑素细胞；12).将收集的黑素细胞用配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中；13).按照梯度冻存方法冻存黑素细胞。步骤1)中，双抗含量优选0％-5％，酒精浸泡时间优选10-200s；步骤3)中，将皮肤组织修剪成宽为0.5-10mm的组织块，消化酶优选中性蛋白酶，消化条件优选4℃，消化时间优选8-18h；步骤4)中，消化条件优选37℃，消化时间优选40-60min；步骤5)中，优选100-200目不锈钢网筛进行过滤，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min；步骤6)中，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度，每24-48h换液一次；步骤7)中，采用梯度消化法提纯黑素细胞，消化条件优选10-30℃，消化时间优选2-3min；步骤8)中，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min；步骤9)中，细胞接种密度优选1×103-1×105个/cm2；步骤10)中，消化条件优选10-30℃，消化时间优选2-3min；步骤10)中，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min。步骤5)中，生长因子可为自主研发的，也可以为商用的生长因子，如Gibcao的HMGS-2，黑素细胞基础培养基可为自主研发的黑素细胞培养基，也可为商用培养基，如GibcaoM254。步骤13)中的梯度冻存方法优选4℃→-20℃→-80℃→液氮的方式，其中细胞在不同温度下的优选放置时间分别为20-40min、40-70min、10-20h、长期，梯度冻存的方式可使用程序降温的细胞冻存盒，也可以利用冰箱人工操作。本专利技术的另一个目的是，提供一种黑素细胞的冻存液，使得黑素细胞在冷冻复苏后，仍然能够保持良好的活性和增值能力。为此，本专利技术采用以下技术方案：黑素细胞的冻存液，其特征在于包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清。进一步地，黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例优选0～92﹕7～10﹕0～93。进一步地，黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例最优选比例是0﹕8﹕92。本专利技术具有的有益效果是：通过本专利技术分离培养及冻存获得的黑素细胞具有以下显著优点：此方法操作简单，黑素细胞纯度较高，无角质细胞和成纤维细胞污染(如图2)，可操作性强；黑素细胞传代后获得的黑素细胞存活率较高，具有良好的增殖能力、优良的黑色素表达能力(如图3)；应用本专利技术提供的冻存配方成分简单，无需添加冷冻剂等物质，梯度冻存的方式灵活，可根据自身条件自行选择，解决了黑素细胞不易冻存的难点，且该冻存配方复苏后细胞存活率较高，生长状态、增殖能力、黑色素表达能力较好(如图4)，冻存配方的专利技术降低了研发周期及成本，对临床白癜风或色素减退患者的治疗及其相关研究意义重大。附图说明图1为实施例1的黑素细胞(含少量角质细胞)显微镜观察图；图2为实施例1的黑素细胞(纯化后)显微镜观察图；图3为实施例1的黑素细胞左旋多巴安染色后显微镜观察图；图4为实施例4的黑素细胞冻存复苏后显微镜观察图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：一种黑素细胞的分离培养方法用含1％双抗的PBS清洗表皮组织，75％医用酒精浸泡100s，转入含1％双抗的PBS培养皿中，清洗数次后剪去皮下组织(脂肪，微血管等)，再次用PBS清洗后，剪成1mm宽的组织块，分散酶中消化，4℃消化16h。用眼科镊将表皮和真皮分离，表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶，37℃消化60min。在消化后的组织中加入适量黑素细胞培养基(GibcoM254+1％HMGS-2)，吹打获得细胞悬液，200目不锈钢网筛过滤，1000rmp离心5min，PBS重悬清洗后再次1000rmp离心5min。适量黑素细胞培养基重悬离心所得的细胞继续培养，置于生化培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，24h后换一次液，之后每48h换液一次；黑素细胞贴壁至50-80％融合时，用胰蛋白酶消化提纯黑素细胞，消化条件25℃，消化时间2-3min。适量黑素细胞培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于黑素细胞的分离培养包括以下步骤：/n1).用PBS清洗表皮组织，医用酒精浸泡，PBS中含有或不含有双抗；/n2).酒精浸泡好的表皮组织转入装有PBS的培养皿中，清洗数次后剪去皮下组织；/n3).将处理好的皮肤组织用PBS清洗后，用消化酶消化，将皮肤组织修剪成一定大小的组织块；/n4).分离的表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶消化；/n5).在步骤4)消化后的组织中加入培养基，吹打获得细胞悬液，过滤，PBS清洗，离心，黑素细胞培养基为黑素细胞基础培养基加生长因子；/n6).适量黑素细胞培养基重悬细胞后，置于生化培养箱继续培养；/n7).黑素细胞贴壁至50-80％融合时，用胰蛋白酶消化提纯黑素细胞；/n8).适量黑素细胞培养基重悬黑素细胞后离心，PBS清洗后再次离心；/n9).黑素细胞培养基重悬黑素细胞后接种到培养瓶中；/n黑素细胞的冻存液配方中包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清；/n黑素细胞的冻存包括以下步骤：/n10).待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化；/n11).将收集的黑素细胞进行离心，PBS重悬清洗后再次离心收集黑素细胞；/n12).将收集的黑素细胞用配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中；/n13).按照梯度冻存方法冻存黑素细胞。/n...

【技术特征摘要】
1.一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于黑素细胞的分离培养包括以下步骤：
1).用PBS清洗表皮组织，医用酒精浸泡，PBS中含有或不含有双抗；
2).酒精浸泡好的表皮组织转入装有PBS的培养皿中，清洗数次后剪去皮下组织；
3).将处理好的皮肤组织用PBS清洗后，用消化酶消化，将皮肤组织修剪成一定大小的组织块；
4).分离的表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶消化；
5).在步骤4)消化后的组织中加入培养基，吹打获得细胞悬液，过滤，PBS清洗，离心，黑素细胞培养基为黑素细胞基础培养基加生长因子；
6).适量黑素细胞培养基重悬细胞后，置于生化培养箱继续培养；
7).黑素细胞贴壁至50-80％融合时，用胰蛋白酶消化提纯黑素细胞；
8).适量黑素细胞培养基重悬黑素细胞后离心，PBS清洗后再次离心；
9).黑素细胞培养基重悬黑素细胞后接种到培养瓶中；
黑素细胞的冻存液配方中包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清；
黑素细胞的冻存包括以下步骤：
10).待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化；
11).将收集的黑素细胞进行离心，PBS重悬清洗后再次离心收集黑素细胞；
12).将收集的黑素细胞用配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中；
13).按照梯度冻存方法冻存黑素细胞。


2.如权利要求1所述的一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于步骤1)中，双抗含量优选0％-5％，酒精浸泡时间优选10-200s；步骤3)中，将皮肤组织修剪成宽为0.5-10mm的组织块，消化酶优选中性蛋白酶，消化条件优选4℃，消化时间优选8-18h；步骤4)中，消化条件优选37...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾金，麻彩丽，孙伟庆，黄伟，
申请(专利权)人：杭州协合医疗用品有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33