一种鼻粘膜类器官培养基及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种鼻粘膜组织的培养基及培养方法，首次将上皮和间充质/基质成分都整合到了基于气液界面法的类器官培养系统中，通过诱导新鲜鼻粘膜上皮组织中的成体干细胞的增殖和分化，能够获得包括纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和基底细胞等多种细胞组成的，接近体内粘膜结构和功能的类器官，成为具有增殖和多谱系分化能力的鼻粘膜体外模型。

A culture medium and method of nasal mucosa organ

【技术实现步骤摘要】
一种鼻粘膜类器官培养基及培养方法
本专利技术涉及类器官培养领域，进一步涉及鼻粘膜类器官培养领域，特别涉及一种鼻粘膜类器官培养基及培养方法。
技术介绍
类器官(Organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。类器官培养是对常规细胞生物学技术的重大改革。与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。多种鼻腔鼻窦疾病与鼻粘膜功能密切相关，利用鼻粘膜上皮细胞体外培养作为疾病模型，可开展粘膜修复损伤、干细胞、纤毛功能等研究。有文献报道利用呼吸道粘膜3D培养体系培养支气管和肺泡上皮类器官，诱导下呼吸道上皮中成体干细胞分化增殖，形成3D上皮细胞团，但这种呼吸道粘膜类器官在全液体环境生长，与人体内呼吸道粘膜气液界面生长的理化环境差距较大，无法形成完整假复层柱状纤毛上皮结构。此外，由于组织特征的差异，下呼吸道粘膜类器官也难以应用于鼻粘膜研究。一些实验室采用二维(2D)气液界面培养法建立鼻粘膜上皮体外模型，但只能体外培养单层鼻粘膜上皮细胞，同样缺乏分化和组织结构，无法模拟人体鼻粘膜组织形态和生理功能。因此，我们提出了全新的气液界面鼻粘膜3D类器官培养体系。鼻粘膜体外模型对于鼻粘膜细胞组织结构、功能以及鼻腔鼻窦疾病研究具有重要意义。虽然多种人源组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养成功原代细胞或者类器官，但是目前暂无关于基于气液界面法的鼻粘膜组织类器官的培养方法的研究及报道，尤其是具体的试验流程、操作步骤、培养条件、即培养基配方尚无尝试及报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种用于鼻粘膜类器官的培养基和培养方法。该方法培养可操作性和重复性好，所用培养基配方价格适中。本专利技术采用的技术方案如下：一种鼻粘膜类器官的培养基，培养基的成分如下：不含Vit-A的B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin1、Wnt3a、A83-01、Nicotinamide、Y-27632、Glutamax、Gastrin、SB202190、青霉素链霉素混合液、wnt7a、IL-6、HEPES的一种或多种。进一步地，培养基的成分及其含量如下：不含Vit-A的B27，1-5X；N-acetylcysteine，0.2-5mM；EGF，10-250ng/ml；Noggin，20-500ng/ml；R-spondin1，50-1000ng/ml；Wnt3a，50-1000ng/ml；A83-01，100-2500nM；Nicotinamide，2-50mM；Y-27632，2-50μM；Glutamax，1-5X；Gastrin，1-25nM；SB202190，2-50μM；青霉素链霉素混合液，1-5X；wnt7a，2-50ng/ml；IL-6，10-250ng/ml；HEPES，0.2-5mM。进一步地，培养基的成分及其含量如下：不含Vit-A的B27，1X；N-acetylcysteine，1mM；EGF，50ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin1，250ng/ml；Wnt3a，250ng/ml；A83-01，500nM；Nicotinamide，10mM；Y-27632，10μM；Glutamax，1X；Gastrin，5nM；SB202190，10μM；青霉素链霉素混合液，1X；wnt7a，10ng/ml；IL-6，50ng/ml；HEPES，1mM。本专利技术还公开了一种鼻粘膜类器官培养方法，具体步骤为：将来源于鼻甲、鼻中隔、鼻底、嗅区、鼻窦、鼻咽部等不同部位的鼻粘膜组织，预处理得到细胞沉淀，将细胞沉淀加入至含有混合胶原溶液的transwell小室内皿中，凝固成凝胶；在transwell小室外皿中加入上述的培养基，恒温培养。进一步的，预处理步骤包括洗涤、切碎、消化、裂解步骤。进一步的，预处理步骤具体为：鼻粘膜组织采用含2％双抗的Hanks液洗涤后，将组织切碎；加入消化酶I消化，离心弃上清，再加入消化酶II消化，离心弃上清，Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀，过滤得到含有鼻粘膜单细胞的滤液，离心弃上清，加红细胞裂解液裂解，离心弃上清得细胞沉淀。进一步的，消化酶I包括collagenasetypeIII、透明质酸酶、Insulin和EGF；消化酶II包括TrypLEExpress和DNaseI酶。进一步的，混合胶原溶液的配制方法如下：A.胶原基质(鼠尾I型胶原蛋白)，B.1X浓缩无菌培养基(DMEM)，C.AdvancedDMEM/F12，D.无菌NaOH溶液(1mol/L)；先将100μlB与1mlC混合，再加入875μlA，最后加入15μlD，得到混合胶原溶液。进一步的，还包括更换培养基步骤：每间隔2-3天更换一次培养基，更换的培养基同权利要求1-3任一项的培养基，优选为条件培养基。进一步的，还包括传代步骤：将内皿中含有细胞的混合胶原转移至15ml离心管，加入100Unit/ml胶原酶IV在37℃下解离15-20分钟，每30天对类器官进行1:2传代。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术首次将上皮和间充质/基质成分都整合到了基于气液界面法的类器官培养系统中，将来源于鼻甲、鼻中隔、鼻底、嗅区、鼻窦、鼻咽部等不同部位的鼻粘膜组织，通过诱导新鲜鼻粘膜上皮组织中的成体干细胞的增殖和分化，能够获得包括纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和基底细胞等多种细胞组成的，接近体内粘膜结构和功能的类器官，成为具有增殖和多谱系分化能力的鼻粘膜体外模型。2.该系统可以使原代鼻粘膜上皮持续增殖分化超过30天，表明在微环境内成功复制了干细胞的生态位，可用于粘膜干细胞，纤毛功能，分泌功能以及鼻部肿瘤、遗传性、变应性、感染性疾病的理想研究模型。3.本专利技术的鼻粘膜组织的类器官培养与鉴定方法操纵流程简单便捷，成功率高，鉴定结果可信度高，技术稳定，可重复性高。实验成本低于现有技术。附图说明图1.气液界面培养法示意图图2.基质胶胶滴法培养中的鼻粘膜类器官图3.气液界面法培养的鼻粘膜类器官及组织切片HE染色照片图4.气液界面法培养出的鼻粘膜类器官动纤毛扫描电镜图具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换，均落入本专利技术保护范围。材料说明：DMEM:购自GIBCO公司，4℃保存，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鼻粘膜类器官培养基，其特征在于，培养基的成分如下：不含Vit-A的B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin 1、Wnt3a、A83-01、Nicotinamide、Y-27632、Glutamax、Gastrin、SB202190、青霉素链霉素混合液、wnt7a、IL-6、HEPES的一种或多种。/n

【技术特征摘要】
1.一种鼻粘膜类器官培养基，其特征在于，培养基的成分如下：不含Vit-A的B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin1、Wnt3a、A83-01、Nicotinamide、Y-27632、Glutamax、Gastrin、SB202190、青霉素链霉素混合液、wnt7a、IL-6、HEPES的一种或多种。


2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，培养基的成分及其含量如下：不含Vit-A的B27，1-5X；N-acetylcysteine，0.2-5mM；EGF，10-250ng/ml；Noggin，20-500ng/ml；R-spondin1，50-1000ng/ml；Wnt3a，50-1000ng/ml；A83-01，100-2500nM；Nicotinamide，2-50mM；Y-27632，2-50μM；Glutamax，1-5X；Gastrin，1-25nM；SB202190，2-50μM；青霉素链霉素混合液，1-5X；wnt7a，2-50ng/ml；IL-6，10-250ng/ml；HEPES，0.2-5mM。


3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，培养基的成分及其含量如下：不含Vit-A的B27，1X；N-acetylcysteine，1mM；EGF，50ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin1，250ng/ml；Wnt3a，250ng/ml；A83-01，500nM；Nicotinamide，10mM；Y-27632，10μM；Glutamax，1X；Gastrin，5nM；SB202190，10μM；青霉素链霉素混合液，1X；wnt7a，10ng/ml；IL-6，50ng/ml；HEPES，1mM。


4.一种鼻粘膜类器官培养方法，其特征在于，将鼻粘膜组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，汪珂，王显文，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东;44