含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种含黑色素的表皮皮肤模型,所述含黑色素的表皮皮肤模型由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，所述含黑色素的表皮皮肤模型中含有黑色素细胞，所述含黑色素的表皮皮肤模型采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物经体外共培养、液下培养和气液面培养而成。

Skin model with melanin and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用
本专利技术属于组织工程学生物材料领域，具体涉及一种含有黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用。
技术介绍
在生物医学研究中，化妆品、药品、化学品等产品上市前都要进行大量的测试以保障产品的安全性与功效性。动物实验一直是该研究领域的主要模式，但由于动物与人的种属差异，实验动物不能准确模拟人体皮肤，使实验结果存在偏差。并且由于3R原则（减少、优化和替代）的提出，促使研究者寻找更合适的检测的方法。目前体外替代方法已经成为现代毒理学研究系统的主要模式和生物医学发展的新方向之一，被欧洲政府及国际法规所接受并推行。目前，国际上已有多种皮肤模型，用于替代动物模型来研究皮肤的不同生物学功能，以及皮肤对化妆品或药物制剂的反应。例如表皮模型、全层皮肤模型（含表皮及真皮层）等。这些重组皮肤模型能够应用于基于皮肤的各类安全性及功效性研究中，如皮肤刺激、屏障渗透、保湿等。目前具有美白功效的化妆品、药物目前深受广大消费者的欢迎，这类产品大多具有多种功效，例如美白保湿。而这些产品在应用于人体前，需要对其安全性及功效性加以验证。目前可用于美白功效检测的皮肤模型较少，原料及化妆品的美白与其它功效多采用不同模型进行验证，检测成本较高，且结果易出现一定的偏差。专利CN200910138703.X公开了一种采用胶原、层粘连蛋白、成纤维细胞制备的支架结构即真皮层，然后接种角质形成细胞、黑色素细胞，并通过体外培养制备出功能性色素等同物。这种方法所制备的皮肤模型可包含真皮层和表皮层。但是这种皮肤模型含有的真皮层中的细胞外基质主要来源于其他动物如牛，后期培养中这些胶原会有较快的降解，易发生结构收缩，从而导致整体模型的损坏，难以应用于长期稳定的检测中。专利CN201019018002.2公开了一种采用生物可降解材料支撑膜模拟真皮层，表皮层利用角质形成细胞、黑色素细胞共同接种，构建的含黑色素细胞的皮肤模型。但该模型中黑色素细胞的分布、活性及功能的发挥不能非常好地反映正常皮肤的反应，而且这种模型结构非常单一，容易受到外界环境的影响而导致模型质量的下降，在后期功效性检测过程中会产生批次间差异从而影响功效结果的判断。专利CN105353114A公开了一种包含成纤维细胞、黑素细胞及角质形成细胞的色素模型。该方法所构建的皮肤模型含有真皮层和表皮层，但其真皮层只含有成纤维细胞，不利于成纤维细胞的伸展及基质分泌，最终导致真皮层死亡，而表皮层未直接与培养基接触，其与培养基之间存在空隙，最终导致表皮层死亡。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用。一方面，提供一种含黑色素的表皮皮肤模型,所述含黑色素的表皮皮肤模型由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，所述含黑色素的表皮皮肤模型中含有黑色素细胞，所述含黑色素的表皮皮肤模型采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物经体外共培养、液下培养和气液面培养而成。优选地，原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物的获取方法为：将离体的人体皮肤组织清洗干净后，去除皮下疏松结缔组织，浸没于Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中浸泡10～15分钟，加入终止液，用弯头吸管轻柔吹打100～200次，过滤、离心后得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物。优选地，所述人体皮肤组织在清洗前经质量分数为70～80%的乙醇浸泡10～90秒。优选地，所述Dispase酶消化液中Dispase酶的用量为1.2U/mL，质量分数为1%。优选地，每100mL所述胰酶/EDTA消化液中含0.025～0.05g胰酶、0.01g的EDTA。优选地，所述终止液为含10%血清的DMEM。优选地，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞体外共培养的过程为：取所述原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，加入第一细胞培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以3.5×105～7.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5%CO2、37℃培养箱中孵育5～7天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物。优选地，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中人表皮角质形成细胞与黑色素细胞的比例为40:1～9:1。优选地，所述第一培养基的配方为：在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加10～30μL/106cells的整合素α3β1、10～50ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯。优选地，所述液下培养的过程为：将所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的Transwell小室中，接种密度为2.0×105～5.0×105/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为150～200μL，在5%CO2、37℃的细胞培养箱中孵育1～3天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。优选地，所述第二培养基的组分为：以含有KC-Growth基础培养基500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松10～50μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β110～30μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯10～50ng。优选地，所述气液面培养的过程为：将所述模型细胞层的第二培养基替换为第三培养液，进行气液面培养，在5%CO2、37℃、95%相对湿度的细胞培养箱中孵育6~8天，每天换液，制备成具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。优选地，所述第三培养液的组分为：以含有KC-Growth基础液500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松50～100μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1为30～60μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为50～100ng和CaCl250～100mg。另一方面，包含以下步骤：采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物进行体外共培养、液下培养和气液面培养，获得具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。优选地，原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物的获取方法为：将离体的人体皮肤组织清洗干净后，去除皮下疏松结缔组织，浸没于Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中浸泡10～15分钟，加入终止液，用弯头吸管轻柔吹打100～200次，过滤、离心后得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物。优选地，所述人体皮肤组织在清洗前经质量分数为70～80%的乙醇浸泡10～90秒。优选地，所述Dispase酶消化液中Dispase酶的用量为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述含黑色素的表皮皮肤模型由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，所述含黑色素的表皮皮肤模型中含有黑色素细胞，所述含黑色素的表皮皮肤模型采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物经体外共培养、液下培养和气液面培养而成。/n

【技术特征摘要】
1.含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述含黑色素的表皮皮肤模型由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，所述含黑色素的表皮皮肤模型中含有黑色素细胞，所述含黑色素的表皮皮肤模型采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物经体外共培养、液下培养和气液面培养而成。


2.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物的获取方法为：将离体的人体皮肤组织清洗干净后，去除皮下疏松结缔组织，浸没于Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中浸泡10～15分钟，加入终止液，用弯头吸管轻柔吹打100～200次，过滤、离心后得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物。


3.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述人体皮肤组织在清洗前经质量分数为70～80%的乙醇浸泡10～90秒。


4.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述Dispase酶消化液中Dispase酶的用量为1.2U/mL，质量分数为1%。


5.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，每100mL所述胰酶/EDTA消化液中含0.025～0.05g胰酶、0.01g的EDTA。


6.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述终止液为含10%血清的DMEM。


7.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞体外共培养的过程为：取所述原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，加入第一细胞培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以3.5×105～7.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5%CO2、37℃培养箱中孵育5～7天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物。


8.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中人表皮角质形成细胞与黑色素细胞的比例为40:1～9:1。


9.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述第一培养基的配方为：在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加10～30μL/106cells的整合素α3β1、10～50ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯。


10.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述液下培养的过程为：将所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的Transwell小室中，接种密度为2.0×105～5.0×105/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为150～200μL，在5%CO2、37℃的细胞培养箱中孵育1～3天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。


11.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述第二培养基的组分为：以含有KC-Growth基础培养基500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松10～50μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β110～30μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯10～50ng。


12.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述气液面培养的过程为：将所述模型细胞层的第二培养基替换为第三培养液，进行气液面培养，在5%CO2、37℃、95%相对湿度的细胞培养箱中孵育6~8天，每天换液，制备成具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。


13.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述第三培养液的组分为：以含有KC-Growth基础液500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松50～100μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1为30～60μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为50～100ng和CaCl250～100mg。


14.含黑色素的表皮皮肤模型的体外构...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨文娟，张晓娥，卢永波，张勇杰，
申请(专利权)人：广东博溪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44