低温保存运输培养基制造技术

本发明专利技术提供一种低温保存运输培养基，包括以下组分：黑素皮肤模型培养液、缓冲体系、琼脂糖、蔗糖、甘氨酸、腺苷、α‑生育酚、维生素C、鞘氨醇‑1‑磷酸、Y‑27632和肝素。所述黑素皮肤模型培养液包括基础培养液、氢化可的松、胰岛素、生长因子、肾上腺素、12‑豆蔻酸‑13‑乙酸佛波醇、干细胞因子、谷氨酰胺、氯化钙和抗生素。

Low temperature preservation and transportation medium

【技术实现步骤摘要】
低温保存运输培养基
本专利技术属于组织工程
，具体来说，涉及一种低温保存运输培养基。
技术介绍
黑素细胞是一种来源于外胚层神经嵴，广泛存在于机体各组织，如表皮、毛囊、真皮、眼、外周神经及交感神经干、软脑膜等结构。黑素细胞产生黑色素颗粒，传递给周围的角质形成细胞，并在角质形成细胞中重新分布，黑色素颗粒能够吸收紫外线，保护皮肤免受紫外线引起的伤害。黑素细胞的体外培养和3D皮肤模型的构建对于研究皮肤色素代谢、皮肤老化、色素障碍性疾病等的研究具有重要意义。近十年来，黑素细胞体外培养方法逐渐成熟，从单一的黑素细胞培养到含黑素细胞等多种细胞混合的皮肤模型，为理解黑色素产生和调节的复杂机制，以及白化病，白癜风，黑素瘤等疾病的发病机理和治疗提供了有用的工具，同时为化妆品和美白产品的安全性和功效性研究提供了有效模型。虽然目前已经成功开发了各种用于制备含黑素细胞的3D皮肤模型的技术，但是这些模型所需的最佳储存和运输条件很少被人关注。通常的皮肤模型产品需要数周才能生产，由于产品中含有活细胞，使得这类产品对于长期储存是不切实际的，所以必须在制造后数小时或数天内使用。目前皮肤模型产品必须在精心控制的条件下储存和运输，以保持活力和功能，因此皮肤模型的推广应用范围受到其保存运输条件的制约。黑素细胞的加入增加了保存运输的难度，相比于只含角质形成细胞的表皮模型，含黑素细胞的皮肤模型生产工艺更加复杂，因为黑色素的产生需要加入一定的诱导条件，如UVB照射或色素诱导因子，而通常需要数天（5～7天）的色素诱导才能出现明显的色素沉着，与此对应，色素的消除也需要数天（5～7天）的时间，所以黑素模型需要更长的生产周期和检测周期。由于含色素细胞的皮肤模型自身性能的特点，要求不仅能够在体外保持长期的组织活力，而且还要保持色素系统的正常生理功能，如关键的色素沉着蛋白质表达，黑色素生成和色素沉着刺激，从而确保测试结果的准确性，这些限制对于开发方便且成本有效的保存运输体系提出了重大挑战。目前常见的组织保存方法有低温保存和常温保存两种，低温保存又可以分为冷藏保存(4℃～8℃)和冷冻保存(-80℃和-196℃)，由于低温冷冻过程中易产生冰晶，破坏细胞膜和渗透平衡诱导组织损伤，影响产品应用效果。此外，冷冻保存需要使用液氮来保持温度低于-100°C，价格昂贵，比较危险，并且不是一般实验室或第三方普遍可用的。因此，组织工程皮肤模型常用的保存温度是4℃～8℃，然而，在4℃～8℃的低温条件下，尤其是在一个相对缺氧的无菌保存条件下，许多细胞在几天后收缩并显示出超微结构损伤，结果这些细胞及其组织在冷藏后不能存活。针对上述问题，相继出现了许多组织低温保存改进方法，如UW液(威斯康星大学研制的低温保存液，HTS-BASE(HYPOTHERMOL)，HTS-FRS，L-15液，DMEM等。但这些保存液主要用于保存离体器官，并且应用此类保存液要求将组织器官完全浸没其中，并需要一定的设备辅助完成保存。而皮肤模型主要用于化妆品药品中化学物质成分的安全性检测，在其表面不能接触任何可能会影响测试结果的化学物质，因此上述保存方法不适用。中国专利200910078302.X中提到在基础培养液中加入营养物质和琼脂，制成固体培养基，用来保存组织工程皮肤，但该培养基仅限于常温保存，因地域、季节等多种因素，要维持常温保存条件需要特殊的温控设备，从而大幅度增加运输成本。中国专利201410418456.X中公开了一种可用于组织工程皮肤模型的低温保存用固体培养基及保存方法。通过给表皮细胞常用培养基中添加低温保护剂，制成基础培养液，然后将该基础培养液与琼脂糖凝胶混合凝固后形成可适于皮肤模型的固体培养基；组织工程皮肤模型嵌入该培养基中，在4℃～8℃保存后，用于检测使用。201410418456.X中公开的固体低温保存运输培养液，虽然涉及到含黑素细胞的组织工程低温保存固体培养基，能在4℃～8℃条件下有效维持模型在保存运输过程后的组织活力(保存运输时间在24h～48h内组织活力下降不超过20%)，但是复苏后模型对UVB等色素诱导刺激失去响应，并且在4℃～8℃条件下不能长期保存，超过48h模型组织活力损失大约在50%左右,不能满足后续检测所需的活力和功能要求。现有技术中尚没有一种较理想的针对含黑素细胞的皮肤模型的低温保存运输体系，理想的低温保存运输体系应具有减少组织细胞低温缺氧损伤，有效保证色素诱导响应功能，同时方便操作及长途运输的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对现有技术中含黑素细胞的皮肤模型在保存运输中存在的组织活力降低、色素诱导响应丢失，保存后无法长期培养等问题，提供一种用于黑素皮肤模型低温保存的低温保存运输培养基。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一方面，提供一种黑素皮肤模型培养液，所述黑素皮肤模型培养液包括基础培养液、氢化可的松、胰岛素、生长因子、肾上腺素、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、干细胞因子、谷氨酰胺、氯化钙和抗生素。优选地，所述基础培养液为K-SFM或F12/DMEM，所述F12/DMEM中F12和DMEM的体积比为1:1。优选地，所述氢化可的松在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为50-200μg/L。优选地，所述胰岛素在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.2-20μg/L。优选地，所述生长因子包括：β-成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和角质细胞生长因子，所述β-成纤维细胞生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为1-10μg/L；所述表皮生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.5-10ng/L；所述角质细胞生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.1-5ng/L。优选地，所述肾上腺素在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为50-200μg/L。优选地，所述12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为1-50ng/L。优选地，所述干细胞因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为10～100μg/L。优选地，所述谷氨酰胺在所述所述黑素模型黑素皮肤模型培养液中的终浓度为2-6mM/L。优选地，所述氯化钙在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.1-5mM/L。优选地，所述抗生素包含青霉素、链霉素或二者的组合，所述青霉素、链霉素或二者的组合在所述黑素模型培养基中的体积配比为0.5-5%。另一方面，提供一种低温保存运输培养基，所述低温保存运输培养基包括以下组分：权利要求1-12任一项所述的黑素皮肤模型培养液、缓冲体系、琼脂糖、蔗糖、甘氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、鞘氨醇-1-磷酸、Y-27632和肝素。优选地，所述缓冲体系选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸在所述低温保存运输培养基中的终浓度为1-50mM/L。优选地，所述琼脂糖的质量浓度为0.5％～5％。优选地，所述蔗糖在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.1～10mM/L。优选地，所述甘氨酸在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述黑素皮肤模型培养液包括基础培养液、氢化可的松、胰岛素、生长因子、肾上腺素、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、干细胞因子、谷氨酰胺、氯化钙和抗生素。/n

【技术特征摘要】
1.黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述黑素皮肤模型培养液包括基础培养液、氢化可的松、胰岛素、生长因子、肾上腺素、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、干细胞因子、谷氨酰胺、氯化钙和抗生素。


2.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述基础培养液为K-SFM或F12/DMEM，所述F12/DMEM中F12和DMEM的体积比为1:1。


3.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述氢化可的松在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为50-200μg/L。


4.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述胰岛素在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.2-20μg/L。


5.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述生长因子包括：β-成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和角质细胞生长因子，所述β-成纤维细胞生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为1-10μg/L；所述表皮生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.5-10ng/L；所述角质细胞生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.1-5ng/L。


6.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述肾上腺素在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为50-200μg/L。


7.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为1-50ng/L。


8.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述干细胞因子在所述黑素皮肤模型培...

【专利技术属性】
技术研发人员：李润芝，卢永波，张勇杰，
申请(专利权)人：广东博溪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44