一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，包括组织解离和清洗、组织消化、细胞接种和细胞培养与维护等步骤。本发明专利技术首次采用大型哺乳动物蒙古马的整个睾丸组织进行组织分离培养以获取睾丸支持细胞，该方法程序简便、成本低廉，能有效去除酶消化过程中产生的聚集组织，从而保持细胞的活性和生物学功能；同时也能有效去除在分离培养过程中产生的杂质细胞，从而提高支持细胞分离效率，为后续生殖细胞的研究提供基础。

A method of isolating and culturing Sertoli cells of Mongolian horse testis in vitro

【技术实现步骤摘要】
一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法
本申请涉及生物
，尤其涉及一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法。
技术介绍
支持细胞(Sertoli又称STO)，是位于曲细精管基膜上的唯一一种体细胞，其贯穿于精子发生的全部过程。相邻的两个支持细胞之间形成小瓮，生精细胞位于其中，由于生精上皮没有血管，其所需要的营养物质和代谢产生的废物都需要经过支持细胞供给和排出。精子发生所需要的能源储存于支持细胞中，当精子发育停止时，支持细胞中的能源增加，反之减少。由此可以认为支持细胞对生精细胞的各个阶级发育起着支持、保护、吞噬和营养作用。支持细胞的基底部紧密相连曲细精管基膜这是构成血睾屏障的基础，因此支持细胞参与睾丸的豁免功能。研究表明，支持细胞还可以分泌一些营养因子，例如胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、表皮生长因子(EGF)等可以维持细胞周边环境并促进干细胞生长。所以体外培养支持细胞有助于研究其各种生物学特性及功能，以便于人们能更好地控制精子发生过程，为畜牧业生产及临床医学提供方便。现有技术中，提取睾丸支持细胞是在室温下对睾丸组织样品采集后消毒、脱囊、分离白膜鞘膜和组织剪碎处理，采用两步酶(胰酶和胶原酶)或者混合酶(胰酶胶原酶和透明质酸酶)进行消化，通过细胞筛过滤得到悬液，所得细胞经过接种培养后使用Tris-Hcl进行低渗处理以达到去除生精细胞目的。但是，将采集的样品在室温进行消毒、脱囊、分离包膜鞘膜和组织剪碎等操作的过程中，会增加细胞的代谢，易造成组织发生黏连融合，加大了对细胞的损伤，降低了细胞成活率，为后期分离培养细胞造成困难，且在操作过程中会产生红细胞等杂质细胞。同时，采用两步酶(胰酶和胶原酶)或者混合酶(胰酶胶原酶和透明质酸酶)进行组织消化时，会产生粘稠状聚集团体，不利于细胞释放和后期的细胞过滤。此外，接种培养后使用Tris-Hcl进行低渗处理去除生精细胞的同时也会去除支持细胞，必须根据不同种属细胞来确定处理时间，要求实验者要有丰富经验。现有技术中也有报道使用流式细胞分选仪或者免疫磁珠分选仪进行小鼠支持细胞的体外分离纯化和培养。但是，一方面，流式细胞仪和免疫磁珠分选仪虽然可以高效率地纯化出支持细胞，但仪器成本昂贵并需要特殊的标记物。另一方面，目前这方面技术仅局限于对小鼠支持细胞的体外培养，种属适用范围太单一。根据本领域技术常识，对支持细胞的分离培养应该从青春期前开始，此时的细胞更适应体外培养且没有生精，支持细胞随年龄增长逐渐下降。目前对小鼠的支持细胞研究较多，也有一些关于人支持细胞原代培养的研究，然而，这些技术绝大多数是从睾丸活检中获得的，而不是整个睾丸组织。对于大型哺乳动物却鲜为报道。
技术实现思路
鉴于
技术介绍
中存在的问题，本申请的目的在于提供一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法。为了达到上述目的，本申请所提供的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，包括如下步骤：(1)组织解离和清洗在4℃环境中，将采集的蒙古马睾丸组织样本置于冰上，消毒、脱囊、分离白膜和鞘膜、剪碎、除去血管；清洗后收集到离心管中，反复置于冰上进行重力沉淀；对重力沉淀后的样本，用甘氨酸溶液进行迅速渗透，然后使用缓冲液清洗；对清洗后的样本进行吹打，使生精小管从组织中解离；(2)组织消化将生精小管置于DNaseI溶液中，在室温下孵育5～10分钟；然后用培养基终止消化，弃上清，对沉淀用HBSS冲洗后置于冰上进行重力沉淀；将沉淀物用胶原酶溶液消化，在37℃下孵育20～40分钟，得到消化后的组织；清洗消化后的组织，除去聚集体，离心并去除上清液；加入胰蛋白酶溶液和脱氧核糖核酸酶溶液，继续消化10～30分钟，使用培养基进行终止消化，在室温下离心，弃上清，使用培养基将离心所得的组织碎片和细胞进行重悬，对重悬液使用注射器针头反复吸取，使细胞解聚；(3)细胞接种对细胞解聚之后的样本进行细胞筛过滤，滤液重悬，接种于培养皿中，进行孵育1～2天，除去漂浮的细胞，进行纯化；(4)细胞培养与维护观察细胞生长状态，按时更换培养基并适时传代，即得蒙古马睾丸支持细胞。相对于现有技术，本专利技术至少具有如下突出的技术效果：(1)在组织解离和清洗步骤中，所有操作均在4℃环境中的冰上进行，降低了细胞的代谢，为支持细胞的存活率提供了保障，并且可有效防止组织发生黏连，有利于实验的进行和细胞的提取。尤其是在对组织进行剪碎之后，反复置于冰上、运用重力沉淀原理机械地去除红细胞以及部分游离间质细胞，对红细胞及游离间质细胞的去除非常充分。(2)在组织清洗时，使用甘氨酸溶液对样本进行迅速渗透，然后使用缓冲液清洗，能有效去除生精细胞，即使在后期接种发现含有生精细胞，该生精细胞也已经被破坏，经过传代即可去除，从而避免现有技术中在接种后使用Tris-Hcl进行处理时对支持细胞产生的不良影响。(3)在组织消化步骤中，在使用胰蛋白酶和胶原酶的基础上，还使用了脱氧核糖核酸酶(DnaseI)，DnaseI可消除大量因细胞破裂释放的DNA，防止细胞解离过程中产生的粘附现象，为清洗提供便利。(4)本专利技术首次采用大型哺乳动物蒙古马的整个睾丸组织进行组织分离培养。相对于现有技术中对小鼠等小型动物支持细胞的体外分离纯化，本专利技术面临更多的技术困难：首先，在取材方面，由于支持细胞随着年龄的增长呈下降趋势，因此取材要求在青春期以前最好，小鼠的年龄较为容易控制和掌握。其次，大型哺乳动物的睾丸相对于小鼠的睾丸在进行脱囊和组织分离等具体操作方面的难度较大。再次，曲细精管占睾丸组织的60～80％，大型哺乳动物睾丸取材约每个睾丸取1～3g，而小鼠是整个睾丸组织，也影响细胞的产量。本专利技术在进行组织机械剪碎和酶消化支持前的预处理已经在很大程度上去除了杂质细胞，在后期接种之后结合差异贴壁法使细胞得到了纯化，从而避免了借助昂贵仪器的使用。差异贴壁法是根据提取的睾丸细胞悬浊液中的各种细胞贴壁时间不同进行分离纯化，将细胞悬浊液接种于预先使用明胶包被处理的培养皿中，接种5～8h，明胶具有吸附细胞的功能，可以使体细胞优先贴壁。由于体细胞优先贴壁而其他生殖细胞还处于悬浮状态或者贴壁不牢，此时用移液枪轻轻吹打，将悬浮细胞和贴壁不牢吸走去除，剩余的体细胞继续培养，该方法简便、高效、快速，且可以有效地纯化细胞。综上，本专利技术提供了一种简便、高效且快速体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，该方法程序简便、成本低廉，能有效去除酶消化过程中产生的聚集组织，从而保持细胞的活性和生物学功能；同时也能有效去除在分离培养过程中产生的杂质细胞，从而提高支持细胞分离效率，为后续生殖细胞的研究提供基础。优选地，所述组织解离和清洗的步骤中，反复置于冰上进行重力沉淀的操作为：将所述离心管摇晃后置于冰上5～10分钟，弃上清，重复3～5次。优选地，所述胶原酶溶液为IV型胶原酶和DNaseI溶解于HBSS中得到的溶液。胶原酶对于降解细胞外基质是必需的，在组织的解离中起着至关重要的作用。优选地，所述甘氨酸溶液为：青霉素、链霉素、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)组织解离和清洗/n在4℃环境中，将采集的蒙古马睾丸组织样本置于冰上，消毒、脱囊、分离白膜和鞘膜、剪碎、除去血管；清洗后收集到离心管中，反复置于冰上进行重力沉淀；对重力沉淀后的样本，用甘氨酸溶液进行迅速渗透，然后使用缓冲液清洗；对清洗后的样本进行吹打，使生精小管从组织中解离；/n(2)组织消化/n将生精小管置于DNase I溶液中，在室温下孵育5～10分钟；然后用培养基终止消化，弃上清，对沉淀用HBSS冲洗后置于冰上进行重力沉淀；将沉淀物用胶原酶溶液消化，在37℃下孵育20～40分钟，得到消化后的组织；/n清洗消化后的组织，除去聚集体，离心并去除上清液；加入胰蛋白酶溶液和脱氧核糖核酸酶溶液，继续消化10～30分钟，使用培养基进行终止消化，在室温下离心，弃上清，使用培养基将离心所得的组织碎片和细胞进行重悬，对重悬液使用注射器的针头反复吸取，使细胞解聚；/n(3)细胞接种/n对细胞解聚之后的样本进行细胞筛过滤，滤液重悬，接种于培养皿中，进行孵育1～2天，除去漂浮的细胞，进行纯化；/n(4)细胞培养与维护/n观察细胞生长状态，按时更换培养基并适时传代，即得蒙古马睾丸支持细胞。/n...

【技术特征摘要】
20191205 CN 20191123253991.一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)组织解离和清洗
在4℃环境中，将采集的蒙古马睾丸组织样本置于冰上，消毒、脱囊、分离白膜和鞘膜、剪碎、除去血管；清洗后收集到离心管中，反复置于冰上进行重力沉淀；对重力沉淀后的样本，用甘氨酸溶液进行迅速渗透，然后使用缓冲液清洗；对清洗后的样本进行吹打，使生精小管从组织中解离；
(2)组织消化
将生精小管置于DNaseI溶液中，在室温下孵育5～10分钟；然后用培养基终止消化，弃上清，对沉淀用HBSS冲洗后置于冰上进行重力沉淀；将沉淀物用胶原酶溶液消化，在37℃下孵育20～40分钟，得到消化后的组织；
清洗消化后的组织，除去聚集体，离心并去除上清液；加入胰蛋白酶溶液和脱氧核糖核酸酶溶液，继续消化10～30分钟，使用培养基进行终止消化，在室温下离心，弃上清，使用培养基将离心所得的组织碎片和细胞进行重悬，对重悬液使用注射器的针头反复吸取，使细胞解聚；
(3)细胞接种
对细胞解聚之后的样本进行细胞筛过滤，滤液重悬，接种于培养皿中，进行孵育1～2天，除去漂浮的细胞，进行纯化；
(4)细胞培养与维护
观察细胞生长状态，按时更换培养基并适时传代，即得蒙古马睾丸支持细胞。


2.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述组织解离和清洗的步骤中，反复置于冰上进行重力沉淀的操作为：将所述离心管摇晃后置于冰上5～10分钟，弃上清，重...

【专利技术属性】
技术研发人员：李蓓，宋连杰，张心壮，赵一萍，白东义，芒来，任秀娟，崔迎迎，特日格乐，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙;15