人类输卵管上皮细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：获取壶腹部输卵管组织，置于消化液中消化；消化终止后，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3‑5h；预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密，然后进行饥饿处理培养2天收取细胞。本申请通过特定的消化液对输卵管组织进行完全消化，而且消化比较温和，不会破坏细胞的形态，此外，在培养过程中对培养基进行了优化。本发明专利技术通过上述培养方法，获得了大量的输卵管上皮细胞，而且纤毛分化比例高，为相关的研究提供了很大的便利。

Culture method of human oviduct epithelial cells

【技术实现步骤摘要】
人类输卵管上皮细胞的培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种人类输卵管上皮细胞的培养方法。
技术介绍
输卵管一直被认为是被动的生殖，作为受精的场所和运输配子和着床前胚胎的通道。越来越多的证据表明，输卵管还调节精子的功能，并促进着床前胚胎的发育。输卵管的后几种功能是由其上皮细胞介导的。输卵管的管腔内衬有由分泌细胞和纤毛细胞组成的柱状上皮，分泌细胞和纤毛细胞在调节异种生殖的上皮表面方面都具有关键作用。分泌细胞产生的粘液、纤毛的摆动促进配子的运输。这些细胞类型在输卵管不同区域的比例在生殖周期中发生变化。尤其是壶腹区的上皮细胞正在积极合成和分泌各种分子到输卵管的腔内，包括补体蛋白-3和半月形细胞和腮腺蛋白，已知这些分子可以刺激着床前胚胎的发育。此外，最近的研究表明，一些浆液性卵巢癌可能来自输卵管上皮。原位输卵管壶腹部上皮中以纤毛上皮细胞为主，另一种类型的上皮细胞为分泌型上皮细胞。已经有人提出，输卵管纤毛细胞是由分泌样表型的细胞分化而来的。众所周知，体外培养的输卵管上皮细胞失去了与原位上皮相关的形态学特征，包括纤毛。目前尚不清楚在原代培养中缺乏纤毛细胞是由于这些细胞未能粘附和存活，还是由于体外衰退或去分化的过程。对于纤毛细胞和分泌细胞分化的分子机制，气管具有与输卵管相似的上皮结构，是具有代表性的模型。一些研究表明，Notch信号控制纤毛细胞和分泌细胞的平衡。在发育中的气道中，Notch激活成功地以牺牲纤毛细胞为代价来驱动分泌细胞的形成，而Notch信号的抑制导致纤毛细胞数量的增加和伴随的分泌细胞生成的减少。RachelW.S.关于人生殖系统上皮细胞培养，其结果中并未明显展示输卵管原代上皮细胞中发现纤毛。HisaoAndo等人建立了永生化的输卵管上皮细胞系，命名为NT/T-S，根据其结果可发现纤毛与微绒毛，但其纤毛细胞分化比例较低。MaobiZhu等人根据气管上皮培养模型提出了关于猪输卵管原代上皮细胞培养方法，但由于培养皿限制，其细胞数量较少。我们根据上述培养方法存在的不足，拟提供一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，对输卵管原代上皮细胞的培养方法进行改良。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，改良了关于输卵管原代上皮细胞步骤，纤毛分化比例高，更利于后续实验及研究。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术的第一个方面是提供一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：步骤一，将手术切下来的输卵管纵向剖开，置于HamF12缓冲液中去除输卵管侧面多余的肉；步骤二，将步骤一处理后的输卵管置于消化液中消化14-20h；步骤三，终止消化后，颠倒，吸取上层液体，离心，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3-5h；步骤四，预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密；步骤五，对步骤四中长密的细胞进行饥饿处理培养分化纤毛；步骤六，收取样品；其中，所述消化液2700ulHamF12培养基(+左旋谷氨酰胺+青霉素+链霉素)+300ul蛋白酶E+9ulDNA酶I；进一步地，蛋白酶E的终浓度为0.15％，DNA酶I的终浓度为0.1mg/ml；所述完全培养基包括基础培养基、胰岛素、铁传递蛋白、霍乱毒素、上皮细胞生长因子(EGF)、牛垂体提取物、胚牛血清(FBS)、视黄酸(RA)和原代细胞抗生素(primocin)。进一步地，胰岛素的浓度为10μg/ml，铁传递蛋白的浓度为5μg/ml，霍乱毒素的浓度为0.1μg/ml，EGF的浓度为25ng/ml，牛垂体提取物的浓度为30μg/ml。进一步地，所述基础培养基的配制方法为在含有15mMHEPES和L-谷氨酰胺的DMEM-Ham'sF-12培养基中加入0.072mol/lNaHCO3、0.08mol/lL-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。进一步地，步骤一中的输卵管主要取自壶腹部。进一步地，步骤二中的消化时间为16-18h。进一步地，步骤三中培养至原纤维细胞贴壁。进一步地，步骤四中细胞长密的状态为细胞与细胞间挤得紧紧的，呈现方型，而且细胞很小。进一步地，步骤五中的饥饿处理培养时间为1-2天，所使用的培养基为基础培养基加入体积占比为2％的血清替代品和0.08mol/lL-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本申请提供了一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，通过特定的消化液对输卵管组织进行完全消化，而且消化比较温和，不会破坏细胞的形态，对输卵管在培养过程中对培养基进行了优化。通过上述培养方法，获得了大量的输卵管上皮细胞，而且纤毛分化比例高，为相关的研究提供了很大的便利。附图说明图1为本专利技术一实施例中细胞鉴定的免疫荧光图谱(其中，第一排为本专利技术实施例的结果，第二排为对比例的结果，分别染ace-tublin和DAP；ace-tublin为纤毛细胞标志物，DAPI为细胞核标志物)；图2为本专利技术一实施例中纤毛细胞分化比例统计图；图3为本专利技术一实施例中培养过程中的细胞生长曲线。具体实施方式本专利技术提供了一种人类输卵管上皮细胞的培养方法。下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。以下过程中使用的试剂及其来源、浓度和保存温度如下：原代细胞抗生素(1000x)：anti-pm-2(InvivoGen)，保存浓度为50mg/ml，保存温度为-20℃。蛋白酶E(10x)：P6911-1G(Sigma)以15mg/ml的浓度溶解在F-12/GPS中，保存温度为-70℃，溶解温度为4℃。DNaseI(1000x)：保存浓度为1mg/ml(溶解溶液为酸盐缓冲液)，保存温度为-20℃。胰岛素：I6634(Sigma)，保存浓度为2mg/ml(溶解在pH2-3，1mM盐酸溶液中)，保存温度为-20℃。铁传递蛋白：T8158(Sigma)，保存浓度为5mg/ml(溶解在无菌水中)，保存温度为-20℃。霍乱毒素：C8052(Sigma)，保存浓度为1mg/ml(溶解在无菌水中)，保存温度为-20℃。EGF：E4127(Sigma)，保存浓度为0.1mg/ml(溶解在含有0.1％BSA的PBS溶液中)，保存温度为-20℃。BPE(牛垂体提取物)：P1167(Sigma)354123(BD)，保存浓度为1mg/ml或者1.5mg/ml(溶解在MTEC基础培养液中)，保存温度为-20℃。视黄酸(RA)：R2625(Sigma)，保存温度为-80℃。F-12K：货号21127-075(Invitrogen)。实施例一本实施例提供人类输卵管上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一，将手术切下来的输卵管纵向剖开，置于Ham F12缓冲液中去除输卵管侧面多余的肉；/n步骤二，将步骤一处理后的输卵管置于消化液中消化14-20h；/n步骤三，终止消化后，颠倒，吸取上层液体，离心，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3-5h；/n步骤四，预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密；/n步骤五，对步骤四中长密的细胞进行饥饿处理培养分化纤毛；/n步骤六，收取样品；/n其中，所述消化液为包含左旋谷氨酰胺、青霉素和链霉素的Ham F12培养基、蛋白酶E以及DNA酶I；/n所述完全培养基包括基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、霍乱毒素、上皮细胞生长因子(EGF)、牛脑垂体提取物、胚牛血清(FBS)、视黄酸(RA)和原代细胞抗生素。/n

【技术特征摘要】
1.人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将手术切下来的输卵管纵向剖开，置于HamF12缓冲液中去除输卵管侧面多余的肉；
步骤二，将步骤一处理后的输卵管置于消化液中消化14-20h；
步骤三，终止消化后，颠倒，吸取上层液体，离心，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3-5h；
步骤四，预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密；
步骤五，对步骤四中长密的细胞进行饥饿处理培养分化纤毛；
步骤六，收取样品；
其中，所述消化液为包含左旋谷氨酰胺、青霉素和链霉素的HamF12培养基、蛋白酶E以及DNA酶I；
所述完全培养基包括基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、霍乱毒素、上皮细胞生长因子(EGF)、牛脑垂体提取物、胚牛血清(FBS)、视黄酸(RA)和原代细胞抗生素。


2.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述胰岛素的浓度为10μg/ml，所述转铁蛋白的浓度为5μg/ml，所述霍乱毒素的浓度为0.1μg/ml，所述EGF的浓度为25ng/ml，所述牛脑垂体提取物的浓度为30μg/ml。


3.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张健，张慧宇，夏玮，赵晓雅，黄振，齐航，朱茜，何小青，梁桂玲，朱晨锋，
申请(专利权)人：中国福利会国际和平妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：上海;31