本发明专利技术公开了一种稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系，是以新生仔猪非转化肠道上皮细胞系IPEC‑J2为宿主细胞，转染含Cas9的慢病毒表达载体，经过20μg/mL的Blasticidin筛选得到的能够稳定表达Cas9蛋白的转化体。其构建方法为：(1)含Cas9的慢病毒表达载体的构建；(2)转化HEK293T细胞；(3)转染IPEC‑J2细胞；(4)单克隆筛选。本发明专利技术的猪肠道上皮细胞系IPEC‑J2‑Cas9，能够稳定表达Cas9蛋白，生长曲线和未转化的IPEC‑J2细胞相同，细胞形态与IPEC‑J2细胞相同。本发明专利技术在研究仔猪肠道上皮细胞生长、分化以及应对外源物质刺激方面具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及构建稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系，属于细胞工程
技术介绍
CRISPR-Cas9是细菌中存在的一种对噬菌体基因组或水平转移质粒的适应性免疫系统。当外源DNA侵入细菌时，CRISPR位点转录产生两种前体小RNA，即crRNA和tracrRNA，同时合成具有核酸内切酶活性的蛋白Cas9。由于Cas9能识别外源DNA中的PAM位点和crRNA5’端20个碱基能与外源DNA中碱基互补配对，crRNA、tracrRNA和Cas9组成的核酸蛋白复合体能特异性地切割外源DNA。细菌来源的CRISPR-Cas9或其稍加变化后的形式sgRNA(crRNA和tracrRNA嵌合体)-Cas9能移植到真核生物中并行使一种能程序化设计的核酸内切酶功能，有双链切口(DSB)的DNA经NHEJ或HDR等机制修复后，在切割位点的基因便产生插入、缺失或替换等编辑效应。CRISPR-Cas9不仅可以对一个或几个基因进行操作，获得一个或多个基因被敲除的细胞或动物模型，而且能够扩展到基因组水平，规模化构建一个物种各基因被敲除的文库用于解析复杂的细胞或个体生命过程。与传统的基因敲除方法相比，CRISPR-Cas9不会引入外源DNA片段，所获得的细胞系或动物个体不含外源DNA片段。将所需研究基因的sgRNA导入稳定表达Cas9基因的细胞系中，可以获得缺失该基因(或多个基因)的细胞，为研究该基因(或多个基因)功能提供新的手段。同时，所获得的特异基因缺失的基因组编辑细胞系也可为培育安全转基因动物个体提供核移植材料。在集约化养猪生产中，早期断奶仔猪容易出现消化不良、腹泻、生产性能下降等“断奶仔猪应激综合征”现象。许多国内外的学者都在尝试用猪源肠道细胞系对该综合征进行机理方面的研究。IPEC-J2细胞系来源于新生未哺乳仔猪空肠，由Berschneider HM于1989年分离培养获得。和其他常用的肠道细胞系(例如Caco-2)不同，该细胞系为非转化细胞系，能很好模拟体内生理环境。该细胞系能表达多种与先天免疫相关的细胞因子，能模拟体内肠细胞应对肠道微生物来源刺激时所产生的先天性免疫反应。在体外培养时能根据培养介质的不同进行极化，可以很好地模拟体内肠细胞分化表型。因此，IPEC-J2细胞系是研究新生仔猪肠道吸收和免疫功能的极好体外模型。通过在IPEC-J2细胞系中逐一敲除基因组的功能序列，获得待研究功能性状的细胞，为研究调控“断奶仔猪应激综合征”的机理提供非常重要材料。但是，目前尚未有商品化的能稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系。由于在解剖学结构和消化、吸收、生理代谢等方面的相似性，新生仔猪被认为是新生儿
营养研究的理想动物模型。婴儿与新生仔猪的肠道发育情况非常相似，因此应用基因组编辑过的猪肠道上皮细胞系IPEC-J2-Cas9可以对研究新生婴儿肠道自身发育，对营养物质吸收情况，对外源物质应答提供有力的参考价值。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了构建稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系IPEC-J2-Cas9)。该细胞系既可以用于筛选特异基因缺失或插入的基因组编辑细胞系，还可以为研究特异基因功能或解析微生物与肠道相互作用的信号通路提供新手段。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系，是以新生仔猪非转化肠道上皮细胞系IPEC-J2为宿主细胞，转染含Cas9的慢病毒表达载体，经过20μg/mL的Blasticidin筛选得到的能够稳定表达Cas9蛋白的转化体。所述稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系的构建方法，包括以下步骤：(1)含Cas9的慢病毒表达载体的构建：从pX330扩增SpCas9基因，构建表达Cas9基因和杀稻瘟菌素(Blasticidin)抗性基因的EFS:SpCas9:Flag:P2A:Blast的融合片段，插入慢病毒载体，获得含Cas9的慢病毒表达载体LentiCas9-Blast；与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同组成慢病毒包装系统；(2)转化HEK293T细胞：上述慢病毒包装系统转化HEK293T细胞，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；24h后，换成DMEM/F12完全培养基，继续培养24～48h，收集培养液于离心管中，离心，得慢病毒上清液，分装到细胞冻存管，-80℃冰箱保存，备用；具体的转化HEK293T细胞的方法为：将7×105HEK293T细胞接种到细胞培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中过夜(10～14h)培养，待长到60～80％融合度时，得HEK293T细胞培养液，备用；取两个1.5mL离心管，其中一个离心管中加入20μL无血清浓度培养基、1μg LentiCas9-Blast质粒、750ng psPAX2质粒和250ng pMD2.G质粒，混匀，室温静置5min；另外一个离心管中加入74uL无血清浓度培养基、6uLHD转染试剂；两管混合，室温下温育20min，加入上述的HEK293T细胞培养液，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；24h后，换成DMEM/F12完全培养基，继续培养24～48h，收集培养液于15mL离心管中，离心，取上清液分装到细胞冻存管，-80℃冰箱保存；(3)转染IPEC-J2细胞：培养IPEC-J2细胞至融合度70～80％，然后加入慢病毒上清液，慢病毒转染12h后，换成新鲜的培养基，继续在37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中培养12h；随后，更换成含20μg/mL Blasticidin的新鲜培养基，37℃、5％CO2恒温细胞培养箱培养转染细胞5～7d，收集转染细胞，备用；(4)单克隆筛选：用培养基将上述(3)中的转染细胞采用有限稀释法稀释成7～8个细胞/mL，加入96-孔板中的各个孔中，使得每个孔的细胞平均数为1.4～1.6个；待单细胞长成细胞团后，移到12-孔板中作扩大培养，收集细胞，即得到稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系，分装，保存在液氮中。上述步骤中，未详尽描述、未特别指明的技术，均为现有技术中已有的常规技术手段，均可按照常规分子生物学和细胞生物学实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件进行。本专利技术的稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系IPEC-J2-Cas9，能够稳定表达Cas9蛋白，生长曲线和未转化的IPEC-J2细胞相同，细胞形态与IPEC-J2细胞相同。本专利技术的稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系IPEC-J2-Cas9，可以用于和sgRNA结合构建特异基因(功能序列)或多个基因(功能序列)敲除的基因组编辑细胞系，用于研究被敲除基因(功能序列)的细胞学功能，在研究仔猪肠道上皮细胞生长、分化以及应对外源物质刺激方面具有重要的应用价值。本专利技术的细胞系，既可以用于筛选特异基因缺失或插入的基因组编辑细胞系，还可以为研究特异基因功能或解析微生物与肠道相互作用的信号通路提供新手段，填补了目前尚未有可以用于基因组编辑的IPEC-J2-Cas9的细胞系的空白。本专利技术的细胞系，具有以下有益效果：1)提供了尚未有商品化可用于猪基因组编辑的细胞系IPEC-J2-Cas9；2)该细胞系可以用于敲除猪基因组中单个或多个目的基因的应用基础研究，3)该细胞系可获得单个或多个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系，其特征在于：是以新生仔猪非转化肠道上皮细胞系IPEC‑J2为宿主细胞，转染含Cas9的慢病毒表达载体，经过20μg/mL的杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选得到的能够稳定表达Cas9蛋白的转化体。
【技术特征摘要】
1.一种稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系，其特征在于：是以新生仔猪非转化肠道上皮细胞系IPEC-J2为宿主细胞，转染含Cas9的慢病毒表达载体，经过20μg/mL的杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选得到的能够稳定表达Cas9蛋白的转化体。2.权利要求1所述的稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)含Cas9的慢病毒表达载体的构建：从pX330扩增SpCas9基因，构建表达Cas9基因和Blasticidin抗性基因的EFS:SpCas9:Flag:P2A:Blast的融合片段，插入慢病毒载体，获得含Cas9的慢病毒表达载体LentiCas9-Blast；与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同组成慢病毒包装系统；(2)转化HEK293T细胞：上述慢病毒包装系统转化HEK293T细胞，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；24h后，换成DMEM/F12完全培养基，继续培养24～48h，收集培养液于离心管中，离心，得慢病毒上清液，备用；(3)转染IPEC-J2细胞：培养IPEC-J2细胞至融合度70％～80％，然后加入慢病毒上清液，慢病毒转染12h后，换成新鲜的培养基，继续在37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中培养12h；随后，更换成含20μg\...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈庄，刘文华，蒋宗勇，陈中健，朱翠，张群洁，朱庆锋，吴秀菊，张卫娜，
申请(专利权)人：广东省农业科学院农业生物基因研究中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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