用于RNA向导的基因调节和编辑的正交Cas9蛋白制造技术

提供了调控细胞中的靶核酸的表达的方法，包括使用多重正交Cas9蛋白同时和独立调节相应的基因或者同时和独立编辑相应的基因。

Gene regulation and editing of orthogonal Cas9 protein for RNA Wizard

A method of regulating the expression of a target nucleic acid in a cell is provided, including the use of multiple orthogonal Cas9 proteins to simultaneously and independently regulate the corresponding gene or to simultaneously and independently edit the corresponding gene.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请数据本申请要求于2013年7月10日提交的第61/844,844号的美国临时专利申请的优先权，并且该申请的全部内容针对所有目的通过引用结合于此。政府权益声明本专利技术在国立卫生研究院的授权号P50HG005550以及能源部的DE-FG02-02ER63445下获得政府支持。政府对本专利技术享有一定权利。
技术介绍
细菌和古细菌(archaeal)CRISPR-Cas系统凭借与Cas蛋白复合的短向导RNA引导存在于侵袭外来核酸内的互补序列的降解。参见Deltcheva,E.etal.CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII.Nature471,602-607(2011)；Gasiunas,G.,Barrangou,R.,Horvath,P.&Siksnys,V.Cas9-crRNAribonucleoproteincomplexmediatesspecificDNAcleavageforadaptiveimmunityinbacteria.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica109,E2579-2586(2012)；Jinek,M.etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science337,816-821(2012)；Sapranauskas,R.etal.TheStreptococcusthermophilusCRISPR/CassystemprovidesimmunityinEscherichiacoli.Nucleicacidsresearch39,9275-9282(2011)；和Bhaya,D.,Davison,M.&Barrangou,R.CRISPR-Cassystemsinbacteriaandarchaea:versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation.Annualreviewofgenetics45,273-297(2011)。最近化脓性链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR系统的体外重构证实了融合至通常反式编码tracrRNA(“反式激活的CRISPRRNA”)的crRNA(“CRISPRRNA”)足以引导Cas9蛋白序列特异性裂解匹配crRNA的靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9的招募(recruitment)和靶DNA的降解。参见H.Deveauetal.,PhageresponsetoCRISPR-encodedresistanceinStreptococcusthermophilus.JournalofBacteriology190,1390(Feb,2008)。
技术实现思路
本公开的方面涉及向导RNA、DNA结合蛋白和双链DNA靶序列的复合物。根据某些方面，本公开范围内的DNA结合蛋白包括与向导RNA以及与将复合物引导至双链DNA序列的向导RNA形成复合物的蛋白质，其中，复合物结合至DNA序列。本公开的该方面可以称为RNA和DNA结合蛋白至双链DNA或与双链DNA的共定位。以这种方式，可以将DNA结合蛋白-向导RNA复合物用于将转录调节蛋白或结构域定位于靶DNA处从而调节靶DNA的表达。根据一个方面，两个或更多个或多种正交RNA(orthogonalRNA)向导的DNA结合蛋白或一组正交RNA向导的DNA结合蛋白可用于同时和独立调节细胞中DNA中的基因。根据一个方面，两个或更多个或多种正交RNA向导的DNA结合蛋白或一组正交RNA向导的DNA结合蛋白可用于同时和独立编辑细胞中DNA中的基因。应当理解的是，在引用DNA结合蛋白或RNA向导的DNA结合蛋白时，这种引用包括正交DNA结合蛋白或正交RNA向导的DNA结合蛋白。这种正交DNA结合蛋白或正交RNA向导的DNA结合蛋白可以具有核酸酶活性，它们可以具有切口酶(nickase)活性或它们可以是核酸酶无效的(nucleasenull)。根据某些方面，提供了调控细胞中靶核酸的表达的方法，该方法包括将编码互补于DNA(脱氧核糖核酸)的一种或多种RNA(核糖核酸)的第一外来核酸(foreignnucleicacid)引入至细胞中，其中，DNA包括靶核酸，将编码结合至DNA并由一种或多种RNA向导的RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白(nuclease-nullDNAbindingprotein)的第二外来核酸引入至细胞中，将编码转录调节蛋白或结构域的第三外来核酸引入至细胞中，其中，一种或多种RNA、RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白和转录调节蛋白或结构域表达，其中，一种或多种RNA、RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白和转录调节蛋白或结构域共定位至DNA，并且其中，转录调节蛋白或结构域调节靶核酸的表达。根据一个方面，编码RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白的外来核酸进一步编码融合至RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白的转录调节蛋白或结构域。根据一个方面，编码一种或多种RNA的外来核酸进一步编码RNA结合结构域的靶并且编码转录调节蛋白或结构域的外来核酸进一步编码融合至转录调节蛋白或结构域的RNA结合结构域。根据一个方面，细胞是真核细胞。根据一个方面，细胞是酵母细胞、植物细胞或动物细胞。根据一个方面，细胞是哺乳动物细胞。根据一个方面，RNA在约10至约500个核苷酸之间。根据一个方面，RNA在约20至约100个核苷酸之间。根据一个方面，转录调节蛋白或结构域是转录激活因子(transcriptionalactivator)。根据一个方面，转录调节蛋白或结构域上调靶核酸的表达。根据一个方面，转录调节蛋白或结构域上调靶核酸的表达以治疗疾病或有害状况(detrimentalcondition)。根据一个方面，靶核酸与疾病或有害状况相关。根据一个方面，转录调节蛋白或结构域是转录抑制因子(transcriptionalrepressor)。根据一个方面，转录调节蛋白或结构域下调靶核酸的表达。根据一个方面，转录调节蛋白或结构域下调靶核酸的表达以治疗疾病或有害状况。根据一个方面，靶核酸与疾病或有害状况相关。根据一个方面，一种或多种RNA是向导RNA(guideRNA)。根据一<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控细胞中的两种或更多种靶核酸的表达的方法，包括：将编码互补于所述两种或更多种靶核酸的两种或更多种RNA的第一外来核酸引入所述细胞中，将编码分别结合至所述两种或更多种靶核酸并由所述两种或更多种RNA向导的两种或更多种正交RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白的第二外来核酸引入所述细胞中，将编码两种或更多种转录调节蛋白或结构域的第三外来核酸引入所述细胞中，其中，所述RNA、所述正交RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白和所述转录调节蛋白或结构域表达，其中，在RNA、正交RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白、转录调节蛋白或结构域和靶核酸之间形成两种或更多种共定位复合物，并且其中，所述转录调节蛋白或结构域调节所述靶核酸的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.07.10 US 61/844,8441.一种调控细胞中的两种或更多种靶核酸的表达的方法，包括：
将编码互补于所述两种或更多种靶核酸的两种或更多种RNA
的第一外来核酸引入所述细胞中，
将编码分别结合至所述两种或更多种靶核酸并由所述两种或更
多种RNA向导的两种或更多种正交RNA向导的核酸酶无效DNA
结合蛋白的第二外来核酸引入所述细胞中，
将编码两种或更多种转录调节蛋白或结构域的第三外来核酸引
入所述细胞中，
其中，所述RNA、所述正交RNA向导的核酸酶无效DNA结合
蛋白和所述转录调节蛋白或结构域表达，
其中，在RNA、正交RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白、
转录调节蛋白或结构域和靶核酸之间形成两种或更多种共定位复合
物，并且其中，所述转录调节蛋白或结构域调节所述靶核酸的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，编码正交RNA向导的核酸酶无
效DNA结合蛋白的所述外来核酸进一步编码融合至所述正交RNA
向导的核酸酶无效DNA结合蛋白的转录调节蛋白或结构域。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，编码两种或更多种RNA的所述
外来核酸进一步编码RNA结合结构域的靶并且编码所述转录调节
蛋白或结构域的所述外来核酸进一步编码融合至所述转录调节蛋白
或结构域的RNA结合结构域。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是酵母细胞、植物细
胞或动物细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA在约10至约500个
核苷酸之间。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA在约20至约100个
核苷酸之间。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转录调节蛋白或结构域是
转录激活因子。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转录调节蛋白或结构域上
调所述靶核酸的表达。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转录调节蛋白或结构域上
调所述靶核酸的表达以治疗疾病或有害状况。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转录调节蛋白或结构域是
转录抑制因子。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转录调节蛋白或结构域下
调所述靶核酸的表达。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转录调节蛋白或结构域下
调所述靶核酸的表达以治疗疾病或有害状况。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸与疾病或有害状况
相关。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种RNA是向导
RNA。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种RNA是
tracrRNA-crRNA融合体。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA是基因组DNA、线
粒体DNA、病毒DNA或外源DNA。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，激活第一靶核酸并抑制第二靶
核酸。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，抑制第一多种靶核酸并抑制第
二多种靶核酸。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，激活第一一种或多种靶核酸并
抑制第二一种或多种靶核酸。
21.一种改变细胞中的一种或多种靶核酸同时调节细胞中的一种或多种
靶核酸的表达的方法，包括：
将编码两种或更多种RNA的第一外来核酸引入所述细胞中，其
中至少一种RNA互补于待改变的所述一种或多种靶核酸且至少一
种RNA互补于待调节的所述一种或多种靶核酸，
将编码以下的第二外来核酸引入所述细胞中：1)一种正交RNA
向导的蛋白切口酶，具有一个非活性核酸酶结构域并由互补于待改
变的所述一种或多种靶核酸的一种或多种RNA向导，和2)一种或
多种正交RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白，其结合至互补于
待调节的所述靶核酸的一种或多种RNA并由互补于待调节的所述
靶核酸的一种或多种RNA向导，
将编码一种或多种转录调节蛋白或结构域的第三外来核酸引入
所述细胞中，
其中，所述RNA、所述正交RNA向导的蛋白切口酶、所述正
交RNA向导的核酸酶无效DNA结合蛋白和所述转录调节蛋白或结
构域表达，
其中，在RNA、正交RNA向导的蛋白切口酶和待改变的靶核
酸之间形成至少一种共定位复合物，并且其中，所述蛋白切口酶切
割...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治·M·丘奇，凯文·埃斯弗特，普拉尚特·马利，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：美国;US