【技术实现步骤摘要】
本公开涉及用于检测靶标(如中和抗体)的方法、组合物、试剂盒和系统。
技术介绍
1、中和抗体代表了抗体治疗剂的一个重要类别，旨在通过形成抗原-抗体复合物来改变靶标组分的生物活性。在免疫原性测试中，中和抗体或抗药物抗体(ada)的存在往往会引起相应药物的异常pk行为或功效损失。另一方面，能够中和有害物质(即病毒和细胞因子)的抗体可具有巨大的治疗潜力。中和抗体也是疫苗评价方面对病毒的抗性和免疫力的重要指标。中和抗体对许多病毒(如登革热、黄热病和日本脑炎)的保护水平已被建立。目前现有的方法(包括基于功能细胞的测定和竞争性配体结合测定)在敏感性上都具有有限的性能。因此，本领域仍然需要用于检测靶标(如中和抗体)的方法和组合物。
技术实现思路
1、本文提供了用于检测靶标(例如来自样品(如生物样品)的中和抗体)的方法、组合物和试剂盒。在一个方面，本文提供了敏感地检测(针对病毒、细胞因子、白细胞介素或其它蛋白质)中和抗体的通用方法。该方法包括用专门设计的核酸探针标记重组蛋白和抗体，所述核酸探针仅响应于中和抗体并生成可扩增的核酸分子。原则上，本文所述的方法、组合物和试剂盒消除或抑制来自结合抗体的信号，并且可通过qpcr或高通量测序来定量中和抗体浓度。
2、图1中示意性地示出了对核酸延伸进行编程以区分中和结合事件与非中和结合事件的原理。一对结合分子(例如受体-配体对)与专门设计的核酸分子缀合。当该对中的一个成员与靶标结合时(例如，一个成员通过结合至靶标(例如抗体或其它生物分子)而被中和)，通
3、图16中示意性地示出了对核酸延伸进行编程以区分中和结合事件与非中和结合事件的另一原理。一对结合分子(例如受体-配体对)与专门设计的核酸分子缀合。当该对中的一个成员与靶标结合(例如，一个成员通过结合至靶标(例如抗体或其它生物分子)而被中和)时，通常阻止缀合至结合对的核酸分子彼此结合。在靶标存在的情况下，结合对成员a被“中和”，而不能结合至结合对成员b。在这种情况下，由于缀合在b上的核酸序列的“干扰”，a*通常被阻止延伸，或者只有中间序列(b*)通常可延伸至a*。相反，在不存在靶标的情况下，缀合至结合对成员(a)的核酸分子可在末端以同一核酸分子的部分序列(a*)延伸两次或多次，从而生成核酸记录体(例如“靶标”序列c*)。因此，只有当结合对相互作用(例如，受体-配体相互作用)未因靶标(例如，中和抗体)的存在而被破坏时，才会生成独特的序列，并且在一些实施方式中，在不同的实验步骤中，可通过qpcr或下一代测序对生成的序列进行扩增和定量。不能破坏结合对相互作用(例如，破坏受体-配体相互作用)的靶标(例如，结合抗体)生成此类独特的核酸序列。
4、在一些实施方式中，本公开的方法使用结合和非结合部分之间的相互作用时间的差异，以仅在成对报告探针识别相同的靶标时生成核酸记录分子(图4和图11)。
5、在一些其它实施方式中，本公开的方法使用结合部分和非结合部分之间的相互作用时间的差异，以仅在不存在靶标的情况下生成核酸记录分子(图17)。
6、在一些实施方式中，本文公开的方法仅在第一和第二报告探针在靶标存在的情况下彼此紧密邻近时，才利用链置换机制来生成核酸记录分子。例如，参见图4、图11和图16。“链置换”是指如下的机制，通过该机制，具有相同序列的两条核酸链在邻近单个互补核酸链(或链的片段)时，经历针对该互补链的相对快速(例如时间尺度<1s)的竞争，可能通过“随机行走”机制从补体“置换”彼此(参见，例如yurke等，nature 406：605-608，2000；以及zhang等，nature chemistry 3：103-113，2011，以引用的方式将它们各自的内容并入本文)。
7、仅在靶标存在的情况下生成核酸记录分子可消除来自报告探针的信号，并可通过qpcr或高通量测序来对靶标浓度定量。通常，该方法包括使样品与一对报告探针接触，所述报告探针缀合有专门设计的核酸。来自两个报告探针的核酸在靶标存在的情况下相互作用，生成可被检测(例如扩增)的核酸记录体。参见图4和图11。
8、在一些其它实施方式中，该方法包括使样品与一对报告探针及封闭探针接触，所述报告探针及封闭探针缀合有专门设计的核酸。来自报告探针和封闭探针的核酸在靶标不存在的情况下相互作用，生成可被检测(例如扩增)的核酸记录体。参见图16和图17。
9、所述方法、组合物和试剂盒至少包括第一报告探针和封闭探针，以及可选的第二报告探针。
10、在任一方面的一些实施方式中，第一报告探针包含能够与靶标结合的第一靶标结合配体。该第一靶标结合配体连接至专门设计的双链核酸，该双链核酸在两端包含单链toehold和/或配对结构域。例如，双链核酸的每条链在其至少一个末端上包含至少一个单链toehold和/或配对结构域。此外，每条链都包含能够阻止通过聚合酶合成互补链的分子或修饰。
11、在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针包含能够与靶标结合的靶标结合配体。第二报告探针包含第二核酸，所述第二核酸连接至第二靶标结合配体，并且包含与第一报告探针的第一核酸的单链toehold/配对结构域中的一个实质上互补的区域或结构域。在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针的第二核酸进一步包含引物结合结构域。
12、在任一方面的一些实施方式中，第二报告探针包含双链核酸，所述双链核酸在两端包含单链toehold和/或配对结构域，其中，toehold和/或配对结构域中的一个与第一报告探针的双链核酸的单链toehold/配对结构域中的一个实质上互补，并且toehold和/或配对结构域中的另一个与第一报告探针的双链核酸的单链toehold/配对结构域中的另一个实质上相同。在一些进一步的实施方式中，所述双链核酸的链中的一条包含引物结合结构域。
13、在任一方面的一些实施方式中，封闭探针包含封闭配体，所述封闭配体能够直接或间接地与第一报告探针的第一靶标结合配体和/或第二报告探针的第二靶标结合配体结合或形成复合物。换而言之，封闭探针能够通过第一和/或第二靶标结合配体与封闭配体之间的相互作用与第一报告探针和/或第二报告探针形成复合物。靶标对第一报本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中：
3.如权利要求1所述的方法，其中：
4.如权利要求1所述的方法，其中：
5.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
6.如权利要求5所述的方法，其中：
7.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
8.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，提供所述聚合酶使所述核酸中的一种或多种延伸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在检测核酸记录体的存在或不存在之前扩增所述核酸记录体，如果所述核酸记录体存在的话。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体与所述封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与Fc受体、抗体与蛋白A、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
12.如权利要求1-11中任一项
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述靶标为抗体、核酸、小分子或抗原。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述靶标为中和抗体、抗原、刺突蛋白、核酸或小分子。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述抗原包含在疫苗中，或者其中，所述抗原由疫苗编码。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述样品为生物样品。
17.一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含：
18.如权利要求17所述的组合物，所述组合物进一步包含：
19.一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含：
20.一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
21.如权利要求20所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二报告探针，并且其中：
22.如权利要求21所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二封闭探针，并且其中：
23.一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
24.如权利要求24所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二报告探针，并且其中：
25.如权利要求25所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含第二封闭探针，并且其中：
26.一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含：
27.如权利要求27所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含：
28.一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含：
29.一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二报告探针，并且其中：
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二封闭探针，并且其中：
32.一种用于检测样品中的靶标的试剂盒，所述试剂盒包含第一报告探针和第一封闭探针，其中：
33.如权利要求32所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二报告探针，并且其中：
34.如权利要求33所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含第二封闭探针，并且其中：
...【技术特征摘要】
1.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中：
3.如权利要求1所述的方法，其中：
4.如权利要求1所述的方法，其中：
5.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
6.如权利要求5所述的方法，其中：
7.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
8.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，提供所述聚合酶使所述核酸中的一种或多种延伸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在检测核酸记录体的存在或不存在之前扩增所述核酸记录体，如果所述核酸记录体存在的话。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标结合配体和/或所述第二靶标结合配体与所述封闭配体为受体与配体、核酸与核酸结合蛋白、抗体与抗原、抗体的抗原结合片段与抗原、抗体与fc受体、抗体与蛋白a、适体与其结合靶标、或药物与其结合靶标。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述靶标为生物分子。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述靶标为抗体、核酸、小分子或抗原。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述靶标为中和抗体、抗原、刺突蛋白、核酸或小分子。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述抗原包含在疫苗中，或者其中，所述抗原由疫苗编码。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述样品为生物样品。
17.一种用于检测样品中的靶标的组合物，所述组合物包含：
18....
【专利技术属性】
技术研发人员：玄峰，王宇，尹鹏，范慈荣，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：
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